病毒学论文
摘 要： 犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)是犬急性胃肠炎的主要致病因子之一,典型的临床症状包括呕吐、发热和腹泻,通常6周龄～6月龄的幼犬更易感染。20世纪70年代后期出现CPV-2后目前已在世界范围内流行。病原学研究显示CPV基因组替代率与RNA病毒相似,基因组中多个位点出现了新的变异,与病毒致病机制密切相关,引起了科研人员的广泛关注。在检测方面目前开展了多重聚合酶链反应(multiple PCR),聚合酶链式扩增阻碍突变系统(amplification refractory mutation system,ARMS-PCR),隔热式恒温PCR(insulated isothermal PCR,iiPCR),高分辨率熔解曲线PCR(high-resolution melting PCR,PCR-HRM),横向流动试纸条技术(immunocapture-loop mediated isothermal amplification-lateral flow dipstick,IC-LAMP-LFD),聚合酶螺旋反应(polymerase spiral reaction,PSR),重组聚合酶扩增方法(recombinase polymerise amplification,RPA),Luminex液态悬浮芯片系统(Luminex xTAG)和免疫层析(immunochromatography,IC)等方法,在防控方面开展了核酸疫苗、重组亚单位苗、病毒样颗粒等新型疫苗以及治疗性药物研究。论文对CPV的流行病学、病原学、检测方法及防控措施等进行了综述。
关键词： 犬细小病毒; 流行病学; 致病机理; 检测方法; 疫苗;
Abstract： Canine parvovirus(CPV)is one of the major causative agents causing acute gastroenteritis in dogs.The typical clinical signs include vomiting,fever,diarrhoea.Generally,puppies aged 6 weeks to6 months have been found to be more susceptible to CPV infection.Epidemiology study showed that CPV-2 and its variants have been reported worldwide after the emergence of CPV-2 in the late 1970 s.Pathogenicity study showed that CPV genomic substitution rate was similar to those of RNA viruses with observation of multiple mutation sites in the genome.In addition,new mutations were closely realted to the pathogenicity of CPV.The research explored multiple PCR,multiplex amplification refractory mutation systemPCR(ARMS-PCR),insulated isothermal PCR(iiPCR),high-resolution melting-PCR(PCR-HRM),immunocapture-loop mediated isothermal amplification-lateral flow dipstick(IC-LAMP-LFD),polymerase spiral reaction(PSR),recombinase polymerise amplification(RPA),Luminex xTAG assay and immunochromatography(IC).Meanwhile,research on genetic engineering vaccines such as nucleic acid vaccines,recombinant subunit vaccines as well as virus-like particles and potential therapeutic drugs were carried out.This review is helpful for the prevention and control of CPV disease.In summary,studies on epidemiology,pathogenicity,detection methods and vaccine of CPV were updated in this review.
Keyword： Canine parvovirus; epidemiology; pathogenicity; detection method; vaccine;
犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)是犬科动物最常见的、危害最严重的病毒病性致病因子之一,是食肉动物细小病毒的典型代表。CPV对2月龄～4月龄的幼犬危害最大,典型的临床表现包括呕吐,发热,腹泻,脱水。通常病犬难以治愈,发病率和致死率达到70%,对犬类的健康造成了极大的危害,给养犬业带来了重大的损失。CPV基因组替代率与RNA病毒相似[1],近期研究显示多个位点出现了新的变异,引起了科研人员的广泛关注。随着研究的不断深入,在检测方法、流行状况、致病机理、疫苗研发等方面均取得了新的进展。因此,本文对国内外近期研究所取得的新进展进行梳理和阐述,以期为后续CPV的防控提供参考。
1 、病毒起源
犬细小病毒2型(CPV-2)由美国学者Eugster和Nairnl于1977年从患病犬粪便中分离而得,经过研究发现,其是由猫细小病毒(Feline parvovirus,FPV)部分氨基酸位点发生突变而来。CPV-2与犬微小病毒(Minute virus of canine,MVC或CPV-1)二者在DNA水平上同源性较低。1982年我国梁士哲等报道了疑似CPV所致犬出血性肠炎病例,随后1983年徐汉坤等确认本病已在我国流行。CPV发现至今约40年,期间不断有新的基因型和变异位点出现,目前,该病毒已在世界范围内广泛分布。该病的预防主要依靠灭活疫苗或减毒活疫苗,但抗原变异株的出现和母源抗体的影响,在一定程度上引起了人们对商用疫苗效果的质疑[2]。
2 、流行现状
自20世纪70年代末期发现CPV感染以来,该病迅速在美国、日本、比利时、法国、丹麦和澳大利亚传播开来[2]。目前,全世界至少有50多个国家报道过CPV的感染,其中多数国家存在多种不同基因型感染的情况。我国北京、湖北、江苏、四川、甘肃、上海、黑龙江、吉林、辽宁、河北和山东等地均开展过流行病学相关的研究,所有基因型在我国均有报道[3]。CPV拥有多种宿主,狼、狐狸、猫、虎、浣熊、熊、水獭、豺、豹和果子狸等均检出过该病毒(某些报道基于血清学检测)[2],对于这些宿主分离的病毒序列的分析,有助于发现潜在的抗原变异株。
3、 病原学
3.1 、病毒基本特征
CPV属于细小病毒科(Family parvoviridae)、细小病毒亚科(Subfamily parvovirinae)、典型细小病毒属(Genus protoparvovirus)成员,是一种小的、无囊膜的单链DNA病毒[3]。病毒粒子呈正20面体对称结构,由60个结构蛋白装配而成,直径约为25 nm。
3.2 、基因组结构
CPV基因组DNA全长大小约5.2 kb左右,含有2个开放阅读框(ORF),分别编码2个非结构蛋白(NS1和NS2)和2个结构蛋白(VP1和VP2)。P4启动子早期转录翻译形成2个非结构蛋白NS1和NS2。NS1编码基因长2 007 bp,编码668个氨基酸残基,NS1蛋白能够影响病毒复制,并能够引发Caspase途径依赖性的细胞凋亡[4]。NS2编码基因长531 bp,编码176个氨基酸残基,NS2蛋白能够促进病毒的释放,还可以为NS1行使功能提供辅助作用。P38启动子晚期转录翻译形成2个结构蛋白VP1和VP2。VPl编码基因长2 181 bp,编码726个氨基酸残基,该蛋白在病毒衣壳中约有5～6个拷贝。VP2编码基因长1 755 bp,编码584个氨基酸残基,与VP1蛋白相比,在N端缺少143个氨基酸残基。VP2是病毒衣壳的重要组成成分,病毒衣壳中约有54～55个拷贝。VP2包含主要的抗原决定簇,同时含有决定宿主范围的关键位点及与宿主细胞膜上转铁蛋白受体(transferrin receptor,TfR)结合的位点[5]。病毒衣壳组装完成后,VP3蛋白由VP2蛋白裂解降解N端10～15个氨基酸残基形成,其仅在完整的有感染性的病毒粒子中产生。
3.3 、病毒分型及变异株
CPV-2由FPV部分氨基酸位点发生突变而来,与FPV相比,VP2相应位点变化为Arg80Lys、Lys93Asn、Val103Ala、Asp323Asn、Asn564Ser和Ala568Gly。病毒经过不断进化,除最初的CPV-2外,还包括CPV-2a、CPV-2b、New CPV-2a、New CPV-2b和CPV-2c 5种抗原型。CPV-2a与CPV-2相比,VP2相应位点氨基酸残基变化为Met87Leu、Ile101Thr、Ala300Gly和Asp305Tyr。CPV-2b与CPV-2a相比,VP2主要发生了Asn426Asp氨基酸残基变化。CPV-2c与CPV-2b相比,VP2发生了Asp426Glu和Ser297Ala氨基酸残基变化。New CPV-2a/2b与CPV-2a/2b相比,VP2发生了Ser297Ala氨基酸残基变化[2]。值得注意的是,CPV-2c于2000年在意大利被首次发现以来,在美国、德国、希腊、阿根廷和比利时均检出过该病毒[2]。我国于2010年首次检出该型病毒,并于2014年成功分离CPV-2c病毒。近年文献报道,在我国吉林(2010)、北京(2014)、山东(2014)、河南、广西和江苏(2015/2016)等地存在CPV-2c检测阳性的样品[1]。除以上可用来区分不同抗原型的相关位点发生变化外,还有些VP2相应位点氨基酸残基也会发生变化,如Phe267Tyr、Tyr324Ile、Gln370Arg、Thr440Ala和Val555Ile。近年来,也陆续发现了VP2一些新的氨基酸残基位点变化,包括Ala5Gly、Thr21Ala、Gln310Glu、Phe420Leu、Phe345Cys、Asp375Asn、Gln383Arg和Pro410Leu [6],Asn428Asp、Ala514Ser、Ser27Thr和Val562Leu[7]。有研究指出,位于VP2蛋白300位点的氨基酸残基的变化可影响病毒与转铁蛋白受体(transferrin receptors,TfRs)的结合,进而决定宿主的范围及其感染性。可见,这些位点的变化可能与其宿主范围、抗原性和致病性相关,值得进一步深入研究。
3.4 、致病机理
通过检测CPV衣壳蛋白及不同宿主受体和衣壳抗体之间的相互作用,发现三者之间动态的相互作用控制着细胞的感染和宿主范围。研究指出,VP2蛋白Gly299Lys和Ala300Lys氨基酸残基的改变影响了病毒与TfR结合的能力。除与受体的结合外,Cys270Ser氨基酸残基的改变会影响病毒衣壳的稳定性,而Pro272Lys氨基酸残基的改变影响了衣壳的组装,Cys273Ser的改变使得病毒不能从细胞核中转运出来,进而失去活性[8]。CPV感染可导致细胞发生早期凋亡,Caspase在CPV感染引起的凋亡中发挥着重要作用。研究表明,CPV感染能够激活Caspase-9,表明涉及线粒体凋亡途径,包括线粒体的去极化和复极化,以及线粒体活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平的变化。也可以激活Caspase-8,表明死亡受体途径也参与了凋亡过程。另外,Caspase-3在感染过程中也被活化[9]。研究表明,CPV的非结构蛋白NS1是诱导细胞凋亡的重要原因,NS1可以引起Hela细胞凋亡,而且该过程不依赖p53途径。同时,NS1的表达涉及细胞周期在G1期的阻滞以及线粒体相应变化如去极化、细胞色素C的释放、Caspase-9的活化和ROS水平的积累等[4]。CPV晚期感染可诱导核孔复合体(nuclear pore complexs,NPCs)和核纤层蛋白B1在顶端的积累,并伴随着核纤层蛋白A/C(lamin A/C)表达水平的降低。新形成的CPV衣壳位于顶端的NPC附近。 最终引起NPC的顶端富集和核纤层的重组,进而促进晚期感染[10]。随着高通量技术的迅猛发展,相关的高通量测序技术也被应用到CPV致病机制的研究中。将CPV感染猫,通过测定猫空肠的MicroRNA 表达谱,成功富集到对于细胞因子和生长因子非常关键的JAK-STAT信号传导途径,为分析CPV感染和适应的分子机制提供了参考,也为防控该病提供了可选的抗病毒策略[11]。通过iTRAQ定量蛋白质组学分析不同时间点F81细胞对CPV感染的反应,发现29个差异表达蛋白在参与p53调节的网络中富集,研究揭示了CPV感染中涉及的关键细胞因子的系统性变化,有助于了解CPV抗癌活性的分子机制和CPV感染引起的细胞病变效应[3]。此外,通过染色质免疫沉淀和高通量测序发现感染晚期细小病毒复制体富含组蛋白,且2种病毒启动子富含组蛋白H3赖氨酸27乙酰化(H3K27ac),结果表明组蛋白的乙酰化对于病毒基因表达和病毒生命周期的完成至关重要[12]。
4、 实验室诊断方法
4.1、 聚合酶链反应
目前已有很多基于聚合酶链反应(PCR)诊断方法的研究报道。有研究开发了一种三重PCR / RT-PCR检测技术,可快速检测犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV),犬细小病毒(CPV)和犬嵴病毒(Canine kobuvirus,CaKoV) [13]。通过2组引物和探针,可同时检测和区分4种抗原类型CPV-2及其变体CPV-2a、2b和2c[14]。此外,有研究建立了ARMS-PCR(multiplex amplification refractory mutation system-PCR)方法,该方法分两步,先区分CPV-2a与CPV-2b / CPV-2c,随后用特异性引物确定CPV-2c是否存在。ARMS-PCR方法不依赖于测序,可同时检测和分型CPV-2变体[15]。为了满足对CPV现场快速检测的要求,有研究建立了一种隔热式恒温PCR(insulated isothermal PCR,iiPCR)检测方法,该方法借助仪器,反应混合物可自动按顺序通过毛细管中的不同温度区域,在装置内完成PCR所需的3个阶段(变性,退火和延伸),反应过程中探针水解产生的光信号由数据处理模块转换为反应后/反应前的比值,并在显示屏上自动报告为正/负结果。该方法整个过程约1 h,灵敏度是实时荧光定量PCR的98.41%,特异性和一致性较好,可满足临床检测需求[16]。
4.2、 高分辨率熔解曲线技术
针对VP2编码蛋白基因设计2组引物,结合巢式PCR技术建立了高分辨率熔解曲线技术(high-resolution melting,HRM) 的PCR方法(PCR-HRM)。该方法能够根据熔解温度的差异和熔解曲线的形状区分CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c之间的单核苷酸多态性。该方法为CPV的抗原型分型提供了较好的替代方案[17]。
4.3 、环介导等温扩增技术
将免疫捕获和环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP) 技术结合并建立了免疫捕获LAMP方法(immunocapture-LAMP,IC-LAMP),该方法将针对VP2蛋白的兔多抗用于病毒捕获以制备微管,随后捕获的病毒用于后续LAMP,扩增产物可使用琼脂糖电泳分析,或使用酶联免疫吸附测定法(IC-LAMP-enzyme linked immunosorbent assay,IC-LAMP-ELISA)及横向流动试纸条技术(IC-LAMP-lateral flow dipstick,IC-LAMP-LFD)进行分析,其中IC-LAMP-ELISA和IC-LAMP-LFD可在1.5 h内获得检测结果[18]。
4.4、 重组聚合酶扩增方法
重组聚合酶扩增方法(recombinase polymerise amplification,RPA)是一种被广泛认为可以替代PCR方法的新型等温基因扩增技术。针对CPV VP2基因设计引物,经过优化在38℃恒温反应15 min即可获得结果,成功建立了基于RPA的检测方法,其敏感性是普通PCR方法的10倍[19]。此外,结合侧向流动试纸条建立了RPA技术的无需设备的可视化LFS RPA (lateral flow strip RPA)检测方法,该方法可检测CPV-2a、2b和2c。RPA反应结束后,5 min内可在试纸条上看到检测结果。其灵敏度也与实时荧光定量PCR结果相当[20]。
4.5 、Luminex xTAG 方法
针对CDV、CPV、犬副流感病毒(Canine parainfluenza virus,CPIV)、CAV和狂犬病病毒(Rabies virus,RV)基因保守区设计引物,并用生物素标记下游引物。其扩增产物随后通过Luminex荧光读数器以高通量形式进行检测,仪器采集多重PCR产物和标记的荧光微球之间杂交形成的荧光强度,结合相应软件分析检测结果。研究结果表明,Luminex xTAG方法可同时检测犬5种主要病毒,并且检测结果与常规PCR方法检测结果完全一致[21]。
4.6 、免疫层析方法
近年来,市场上有出售的免疫层析(immunochromatography,IC)试纸条,但由于其使用靶向不同表位的单克隆抗体作为捕获和检测抗体,因此价格较高。值得一提的是,用CPV的重组截短的VP2蛋白产生的兔多克隆抗体用作捕获抗体,而商用单克隆抗体用作检测抗体,成功组装成新试纸条,其灵敏度和特异性与商用试纸条基本一致。这种单克隆抗体和兔多克隆抗体组合的方法为降低成本提供了可接受的替代方案[22]。
5、 预防与控制
5.1、 综合防控措施
综合预防主要应注意犬舍清洁通风,保持干燥保暖的同时减少灰尘、有害气体和噪音等对犬造成的应激。户外活动避免到犬集中的地方,避免传染。注意科学饲喂,避免饲喂腐败饲料,尽量饲喂易消化的食物,减少胃肠负担,并形成合适的饲喂规律。经常对犬舍、用具、水槽、料槽等消毒,防止病原体通过此类媒介传播。引进外来犬时应避免引进患病犬,并且在引进初期应隔离饲养。一旦暴发犬细小病毒病,应果断隔离并及早诊断治疗,如不具治愈价值,应及早扑杀并进行无害化处理。
5.2、 特异性免疫
5.2.1 、传统灭活疫苗和弱毒疫苗
目前国内针对CPV的疫苗主要有江西生物药厂和吉林省五星动物保健药厂生产的犬瘟热、犬副流感、犬腺病毒与犬细小病毒病四联活疫苗。国外主要有硕腾公司(Zoetis Inc)生产的犬细小病毒病活疫苗、四联苗和七联苗,英特威国际有限公司(Intervet international B.V.)生产的犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗和四联活疫苗,以及西班牙海博莱生物大药厂(Laboratorios HIPRA,S.A)和梅里亚有限公司(Merial INC)生产的六联苗。
5.2.2、 基因工程疫苗相关研究
除传统的灭活和弱毒疫苗外,研究人员结合分子生物学技术,开展了新型基因工程疫苗的相关探索。研究人员利用多种表达系统表达犬细小病毒VP2蛋白并组装获得病毒样颗粒,利用大肠埃希菌表达系统表达VP2蛋白,该蛋白也能自组装成病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),且抗原表位正确地存在于VLP上。相关研究表明VLP疫苗在CPV预防方面的潜在作用[23]。通过将狂犬病病毒糖蛋白和CPV VP2基因亚克隆到双顺反子载体中,开发了针对犬的狂犬病和细小病毒感染的双顺反子DNA疫苗。研究表明,双顺反子DNA疫苗可用于诱导针对狂犬病和CPV的病毒中和免疫应答[24]。将CPV VP2蛋白的部分抗原表位与霍乱毒素B亚基融合,在转基因烟草叶绿体中表达。当用转基因植物组织粉碎后的悬浮液饲喂小鼠时,血清中能够检测到特异的IgA抗体。联合免疫(单次注射后口服加强免疫)能够在血清中检测到IgG和IgA抗体。尽管诱导了体液应答,但通过口服递送引发的抗体在体外测定中未显示出中和能力[25]。使用传代致弱和携带2个狂犬病病毒(RABV)糖蛋白的重组狂犬病病毒作为载体来表达CPV VP2蛋白,二者均能成功表达VP2蛋白,并在小鼠中产生高水平的狂犬病抗体和针对CPV VP2的抗体。同时超过80%用重组RABV免疫的小鼠可以在RABV标准毒CVS-24毒株攻毒感染的试验中存活。结果表明,表达VP2的重组RABV可以诱导对RABV和CPV的保护性免疫应答,可作为潜在的联合疫苗[26]。相关的VLP疫苗、核酸疫苗、转基因植物疫苗和病毒载体疫苗仍需要进一步评估。
5.3 、其他潜在制剂和组分
除免疫相关制剂外,某些制剂和组分也被用于评估或辅助治疗中。如马脂多糖抗毒素,重组杀菌/通透性增加蛋白,干扰素-ω,奥司他韦,人重组粒细胞集落刺激因子[27],可溶性犬转铁蛋白受体,氯化锂,磷酸化的板蓝根多糖和N-乙酰半胱氨酸。值得一提的是,在2家宠物医院评估66只CPV感染幼犬采用标准治疗和粪便菌群移植治疗的差异,粪便菌群移植组在入院后6 h～12 h,直肠给予10 mL盐水稀释的10 g来自健康犬的粪便。在幸存犬中,与标准治疗组相比,粪便菌群移植组腹泻症状消退快,住院时间短,且差异显着。同时,标准组的死亡率为36.4% (12/33),而粪便菌群移植组死亡率为21.2%(7/33),但无统计学差异,表明粪便菌群移植治疗能更快的消退腹泻症状[28]。
6 、小结
近年来,CPV的基因组序列发生很多变化,产生了很多变异毒株。较多的毒株给临床鉴定分型带来较大挑战,同时防控该病也压力渐增。未来开发灵敏、特异和易用的诊断方法或检测技术仍是重要的研究方向之一。此外,需要评估现有疫苗对变异株的保护能力,在此基础上,明确研发针对新抗原型疫苗的必要性,并探索新型基因工程疫苗预防该病的可能性。在机制研究方面,仍需进一步评估变异株的致病性强弱和跨宿主传播风险。研究该病毒对宿主的影响和分子机制,寻找潜在的治疗靶点,评估针对治疗靶点相关药物用于临床治疗的可行性。
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