病毒学论文
摘 要:文章对非洲猪瘟病毒的病原学特征、流行病学、基因组结构及功能、致病性及致病机制、综合防控措施进行综述,为进一步认识和防控该病提供参考.
关键词:非洲猪瘟病毒; 研究进展;
作者简介: 陈元翠(1996-),女,本科,助理兽医师.
非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起猪的急性、热性、出血性和高度接触性传染病,无明显季节性,一年四季均可发生,通常在感染后10 d内死亡,病死率可高达100%[1].其临床症状和病理变化与猪瘟(古典猪瘟,CSF)相似,在临床诊断时常常误诊为猪瘟,具体表现为精神沉郁、食欲废绝、高热、皮肤充血发绀、流产、水肿、脏器出血、共济失调[2].野猪、家猪和钝缘蜱是ASFV的宿主,猪巨噬细胞是ASFV的靶细胞.ASFV由于基因组强大和逃逸机制复杂,所以目前尚无有效的疫苗预防.ASF是世界动物卫生组织(OIE)法定报告的动物传染病,同时也是《中华人民共和国动物防疫法》规定的一类动物疫病[3].ASF起源于非洲,1921年在非洲的肯尼亚被首次确认,之后蔓延到非洲其他地区以及欧美多个国家,并且有流行扩大的趋势[4,5].我国自2018年8月在辽宁沈阳暴发首例ASF以来,已有31个省(区、市)相继发生疫情,几乎席卷所有省份,对养猪业造成严重损失[6,7,8].本文根据近年国内外学者的研究文献,将ASFV的病原学特征、流行病学、基因组结构及功能、致病性及致病机制和综合防控措施介绍如下,供参考.
1 病原学特征
1.1 形态特征
ASFV是非洲猪瘟病毒科,非洲猪瘟病毒属的唯一成员,是1种大型的双股DNA病毒,病毒粒子呈二十面体对称,平均直径200 nm,病毒分子由内到外分别为核质体、核衣壳、囊膜,囊膜又分为内层和外层[9].ASFV是迄今发现的唯一的DNA虫媒病毒,是1种独特而复杂的病毒,具有"虹彩病毒的外形,痘病毒的内质".国际病毒分类委员会曾在第四、第五次报告中将其分别列入虹彩病毒科和痘病毒科,但是随着病毒基因序列及病毒复制等方面的研究不断深入,发现ASFV与虹彩病毒和痘病毒在某些方面还是存在不同,所以在第六次报告中将其列入"类非洲猪瘟病毒属";1998年正式将ASFV列入1个全新的病毒科---非洲猪瘟病毒科;2005年第八次报告中最终将ASFV列为非洲猪瘟病毒科,非洲猪瘟病毒属的唯一成员[10].
1.2 理化特性
ASFV对环境的抵抗力比较强,可以在环境中长期存活,在pH值4~10之间毒力不会发生明显改变.在血液中可延长存活时间,在一般血液中可存活半年,-70℃冷藏条件下血液中可存活18个月,在脾脏组织中感染力2年内不受影响[11,12].对热比较敏感,在60℃下仅能存活30 min,但耐寒能力极强,持续-20℃条件下可存活10年以上.使用常规消毒剂可以杀死,尤其是使用氯制剂可以有效杀灭,常用消毒剂有10%苯酚溶液、2.3%次氯酸盐、0.8%氢氧化钠、0.3%福尔马林[13].ASFV在冷冻猪肉中可存活15年,在腌肉中也可存活,所以在处理过程中必须严格执行生物安全措施,防止被污染的猪肉制品进一步传播[14].
2 流行病学
2.1 传染源
猪科动物和节肢动物钝缘蜱是ASFV的自然宿主.发病猪和带毒猪是主要传染源(包括携带病毒的组织、血液、各种分泌物和排泄物).欧洲野猪对ASFV敏感,但有3种非洲野猪(疣猪、大林猪、非洲野猪)感染后没有明显的临床症状,呈隐性带毒,是病毒的储存器[15].猪群一旦感染后,传播迅速,发病率高,致猪群大量死亡,康复猪可长期带毒,短期内可再次暴发.未被处理的感染野猪尸体、未被正确销毁或掩埋的家猪尸体、已感染但未表现临床症状的家猪与野猪都是危害严重需要特别关注的传染源.ASFV除了可以通过带毒的宿主传播外,带毒的生肉或肉制品、加工废弃物以及被污染的车辆、设备等均可成为传染源[16].此外,钝缘蜱通过叮咬病猪后终生带毒,成为ASFV的储存宿主和传播媒介[17].
2.2 易感动物
ASFV不感染人,猪是唯一易感的哺乳动物,几乎所有的猪科动物均可感染,没有明显的品种、年龄、性别差异,高度易感的家猪和欧洲野猪常表现明显的临床症状.ASFV不感染猫、狗、牛、羊等动物,但在家兔体内盲传26代仍会致猪死亡[18].
2.3 传播途径
ASF的传播途径较为广泛,主要经过消化道和呼吸道途径侵入猪体.目前发现主要通过4种途径传播.(1)接触传播:与病猪经口或鼻直接接触感染[19],或接触病猪的血液、粪便和病猪使用过的器具等间接传播[20].(2)经食物传播:主要为含病毒的猪制品或泔水饲喂猪后引起猪感染发病.(3)媒介传播:1963年西班牙学者从软蜱体内分离出ASFV,随后认定游走鸟壁虱为ASFV的主要生物媒介及贮存宿主,并确定毛白钝缘蜱在ASF流行病学中有着重要作用;ASFV可在钝缘蜱体内复制并且可通过交配传播,蜱叮咬感染猪后ASFV随血液进入蜱内,随后传播到下一个叮咬目标,甚至整个钝缘蜱属的蜱虫均可以传播本病[21].由于这种寄生虫的广泛存在,所以非洲猪瘟病毒很难消灭,尤其是在蜱虫盛行的季节.(4)其他传播途径:研究表明,ASFV在2 m以内可通过气溶胶传播[22,23].
3 基因组结构及功能
ASFV的基因组是1种线性双链DNA分子,2条链都可以转录.基因组长170~193 kb,由中央为125 kb左右的保守区,两端为可变区(分别为38~48 kb、13~22 kb),以及基因组末端的反向重复序列(2.1~2.5 kb)组成[9].根据中央保守区的可变区(约4 kb)序列的差异性将ASFV分为不同毒株基因型.两端可变区为不同毒株的主要差异所在,这些可变区编码着5个多基因家族,包括假定膜蛋白、分泌性蛋白、核酸代谢酶以及蛋白修饰酶.每个多基因家族都可发生增加、缺失、分化等变异,与病毒逃避宿主防御系统、抗原变异等机制相关,此外由于多基因家族的基因拷贝数不同而导致毒株基因组的长度差异,强毒株多基因家族的基因拷贝数较多,低毒株基因拷贝数少[24].同分离株基因组的重复序列和重复次数存在差异,末端重复序列结构与痘病毒基因组相似但序列不同,在痘病毒基因组中末端重复序列对同源复制中间体的复制和分辨都至关重要,但这在ASFV基因组中尚未有研究.可编码151~167个开放阅读框(ORFs),成熟病毒粒子中含有68种结构蛋白[25,26,27,28].ASFV病毒粒子蛋白按功能主要分为以下几类:(1)4%的蛋白参与病毒形态发生,构成病毒粒子结构的蛋白质,如P220和P62多肽、P54、P72、PE248R、P49和CD2v等,其中P72蛋白是ASFV的主要结构蛋白,由B646 L基因编码,该基因高度保守,有较强的抗原性,且不同病毒株的氨基酸序列差异不大,相较于ASFV的其他结构蛋白有更好的稳定性,是病毒检测中最常用的靶基因[29].此外,对B646L基因(P72蛋白)进行遗传进化分析发现,ASFV的基因组较大且变异频繁,现已发现24种不同的基因型[30].(2)19%的蛋白参与病毒基因转录和RNA修饰.(3)6%的蛋白在维持病毒基因组的完整性中发挥作用.(4)4%的蛋白参与病毒进入细胞的过程.(5)3%的蛋白参与病毒逃逸宿主的免疫系统.(6)10%为其他已知蛋白;比例最大(34%)的仍是未知的蛋白[10].
4 致病性及致病机制
ASFV按毒力分为强、中、低毒力毒株.强毒株主要引发超急性或急性感染,病死率高达90%~100%;中等毒力毒株主要引发亚急性感染,病死率为20%~40%;低毒力毒株主要引发慢性感染,病死率低,为10%~30%.猪感染ASFV后,首先在鼻咽部或扁桃体中进行增殖,通过淋巴和血液循环进入循环系统,引起病毒血症,对血管、淋巴结的内皮细胞进行侵袭,导致相应组织、器官出现出血、浆液性渗出、血栓和梗死等病理变化,以及出现淋巴细胞凋亡、免疫系统受损和淋巴细胞明显减少等特征性表现[31].ASFV感染的主要靶细胞是猪单核-巨噬细胞,所以最早检测到ASFV的地方是猪的单核-巨噬细胞,随后是树突状细胞、内皮细胞、巨核细胞、血小板、中性粒细胞和肝细胞[32].病毒编码的许多蛋白质可以与细胞表面的特异性受体识别结合,进而介导宿主细胞发生胞吞作用,使病毒得以进入(其中细胞脂质胆固醇参与了ASFV的感染过程[33]),随后则利用病毒囊膜与宿主细胞膜的相似相融机理逐步将病毒粒子释放到宿主细胞浆内,完成感染,ASFV颗粒从早期的内涵体移动到后期的大囊泡体,并完成脱壳,释放具有复制能力的基因组.研究表明,针对蛋白P12、P32、P54、P73的特异性外源抗体可以阻断病毒的吸附和进入(与巨噬细胞结合),证明了这4种蛋白都参与了病毒的吸附和内吞过程;位于成熟的病毒粒子内膜的内膜蛋白也对病毒早期侵入宿主细胞起到十分重要的作用,比如p E248R蛋白[34].ASFV进入宿主细胞后,在蛋白的介导作用下,逐步聚集于宿主细胞的细胞核,以自身携带的酶和蛋白因子进行早期m RNA转录和翻译,翻译出病毒复制和加工所需要的各种酶,然后在细胞的细胞浆内完成自我复制,复制方式和痘病毒十分相似[35].通常病毒的入侵会激活细胞的自杀程序,而ASFV则可以抑制细胞的这种调亡过程,使得病毒得以持续复制,是病毒持续性感染的保障.同时,ASFV通过2种切除修复系统来维持病毒基因组的完整:一是DNA前体合成所需的酶系统,如胸苷激酶、核苷酸还原酶等;二是碱基切除修复系统,用来修复水解以及氧化所造成的DNA碱基损伤.ASFV在宿主细胞质核周围的"病毒加工厂"区域进行装配,装配部位集中在微管形成中心和高尔基复合体.在病毒的核蛋白周围包裹着细胞内质网的双层膜形成外膜,在非结构蛋白pB602L的调节下,使核衣壳蛋白P72组装成病毒的二十面体结构,形成ASFV的核衣壳,最后病毒粒子二十面体闭合,病毒DNA嵌入及核心蛋白浓缩,最终形成成熟的病毒粒子[34].组装完成后,成熟的病毒颗粒在驱动蛋白提供的动力下,借助细胞骨架微管运输转移到细胞膜,通过细胞膜的出芽不仅获得了来自细胞膜的单层囊膜,并且分泌到了细胞外[36].研究发现,P54蛋白和PE120R蛋白参与了病毒粒子从装配位点到细胞膜的运输过程.具有感染性的成熟病毒粒子在被释放到胞外后,在病毒粒子表面将形成1层囊膜,该囊膜与ASFV的感染性无关,可能参与病毒对宿主细胞的吸附作用[34].此外,病毒CD2v蛋白参与胞外病毒粒子与红细胞的结合,且可能在病毒的出芽过程中发挥一定作用[37].ASFV主要感染猪的单核吞噬细胞和淋巴细胞,引起细胞坏死,进而导致机体免疫功能低下或不全,产生不完全中和抗体,虽然弱毒株造成的免疫损伤轻微,但感染猪仍然不产生典型中和抗体.
5 综合防控措施
ASFV由于基因组强大和逃逸机制复杂,所以目前尚无有效的疫苗预防.预防和控制该病要依靠"早发现、早扑灭"和实施严格的运输管理及卫生措施,只有严格的卫生措施才能阻止猪与ASFV的潜在接触,降低养殖场再次暴发疫情的可能性.
5.1 普及防控知识,增强防控意识
我国是养猪大国,约占世界生猪养殖数量的50%,ASF疫情对我国的生猪养殖造成巨大损失,所以要加大防控宣传力度,积极防范,可通过电视、网络、宣传册等形式定期开展科普宣传活动,并组织学习培训相关的防控知识[38].
5.2 严格引种
严禁从有疫情的国家、地区引进猪种、精液.非疫区引进猪要经过严格的隔离检疫,观察45天无异常后才可进入生产区混群,严防疫病传入.有条件的大型养殖场应坚持并建立自繁自养体系.
5.3 实行严格的卫生消毒制度
将生产区和生活区严格分开.饲养人员在每次进入生产区时换上经过紫外线消毒的鞋和衣服.在养殖场门口设置消毒池及消毒喷雾器,保证运输车辆经严格消毒后方可进入场内.对车辆及用具定期用0.8%氢氧化钠、0.3%福尔马林或2%次氯酸钠进行消毒.采取隔离防护措施,避免饲养猪与野猪、钝缘蜱接触,并清除传染源.饲槽和饮水器定期消毒.出售生猪后,空猪舍内可用40%甲醛10 m L/m3、高锰酸钾5 g/m3混合进行熏蒸消毒,时间为20~30 min,消毒后要打开门窗通风换气1周以上.
5.4 加强饲养管理
在猪场内给予猪适当运动,提高免疫力.提供清洁饮水,禁止饲喂霉变饲料、餐厨泔水和猪肉制品.定期驱杀体内外寄生虫.
5.5 加强排查监测
加大对生猪交易市场、屠宰场、无害化处理厂、边境省份等重要和关键区域的巡查频次,并开展针对性抽样监测.当有疑似ASF发生时,除及时诊断处置外,应尽快向上级兽医管理部门上报疫情,同时在疫区严格实施封锁、隔离、消毒等综合措施.如果确诊应立即将病猪扑杀,尸体按国家相关规程进行无害化处理.
6 小结
ASF可通过动物产品的国际国内贸易、边境互市、野生动物迁徙和节肢动物媒介等途径传播.ASFV感染的靶细胞是猪的单核巨噬细胞系统,并以其特有基因编码数量众多、机制复杂的病毒蛋白,参与吸附、侵入宿主细胞、复制与装配、逃避免疫防御系统等功能,能更有效地感染宿主细胞,引起猪的急性、热性、出血性临床症状和病理损害.ASFV基因型较多,种类庞大,随着对ASFV生物特性和分子特性研究的不断深入,已从ASFV感染的细胞中分离鉴定出至少64种病毒结构蛋白.虽然有些病毒蛋白的功能尚不清楚,但随着研究的不断深入,ASFV的致病机制将会越来越清晰,同时也会研制出有效预防的疫苗.
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