长沙地区诺如病毒的分布情况调查

　　诺如病毒是引起急性胃肠炎的主要病因之一，在全球范围内，从儿童到成人都可能受到诺如病毒的感染，并可造成大规模流行。由于诺如病毒基因容易突变，其存在多种抗原的类型和基因型。

　　根据诺如病毒的核苷酸序列的序列差异，可以把诺如病毒分为五个基因组类型，其中主要是 GI 和 GII感染人类。近年来，在全国不同地区间歇的爆发小规模的急性胃肠炎，特别是托儿所、幼儿园、养老院等人口密集且抵抗力较差的人群时有发生。本文通过检测急性胃肠炎病人粪便中诺如病毒的种类，来了解在长沙地区诺如病毒的分布情况，为以后防止病毒性胃肠炎提供依据。

　　1 材料和方法

　　1． 1 材料
　　116 例粪便标本收集于长沙市病毒性腹泻患者。RNA 提取试剂、反转录试剂盒、PCR 所需试剂、DNA 纯化试剂盒均采购于 Invitrogen 公司。

　　1． 2 方法
　　1． 2． 1 病毒 RNA 提取 取 5g 粪便样品加入 100mL PBS 溶液中，使之充分震荡悬浮;10000 g / min离心 5 分钟，取上清保存在 －70℃冰箱备用。取上述制备的粪便悬液 140 uL，用 Trizol 提取病毒 RNA，保存于 － 70℃。(RNA 提取方法参照 Trizol 说明书)。

　　1． 2． 2 逆转录反应 以提取的病毒 RNA 为模板，采用六核苷酸随机引物和 superscript II 逆转录酶进 行 逆 转 录。反 应 条 件 为: 30℃ 10min; 42℃30min; 99℃ 5min; 4℃ 5min。

　　1． 2． 3 诺如病毒部分基因克隆 根据之前研究，采用两对引物 G1SKF 和 G1SKR，G2SKF 和G2SKR 分别克隆 GI 和 GII。PCR 反应条件:94℃变性 2min;94℃ 变性 30s，55℃ 退火 30s，72℃ 延伸 2min，35 个循环;72℃ 延伸 10 min。PCR 产物用 1． 2%琼脂糖凝胶电泳检验，纯化回收 320bp 左右的特异性扩增片段。回收的 DNA 片段克隆至PMD18 － T 载体测序。

　　1． 2． 4 DNA 序列测定和分析 将扩增的片段和PMD18 － T 载体连接后，转化到 DH5a 细胞，挑白斑菌进行 RCR 鉴定，得到含目的片段的重组阳性菌株，用于测序分析。

　　2 结 果

　　从 128 个粪便样品中，成功检测到 63(49%)个阳性的样本。根据测序结果构建的系统进化树(表1 和图 1)所示，所有的诺如病毒样品全部属于 GII，其中 GII －4 检出率最高，是导致长沙地区病毒性胃肠炎最主要的诺如病毒株。【表1.图1】

　　
　　3 讨 论

　　本次调查诺如病毒 GII － 4 是引起长沙地区病毒性急性胃肠炎的主要病原体。此外，我们还发现了 GII －3，GII －12 这两种亚型的病毒株。值得注意的是本次发现的 GII － 4 病毒株的基因序列和之前在日本发现的一株 GII －4 诺如病毒很相似，但和在美国和欧洲发现 GII － 4 病毒株基因序列差别较大。这表明，根据不同的群体，诺如病毒变异产生的优势病毒株有所差异。同时，我们发现在诺如病毒衣壳蛋白的基因序列高度的可变性，表明衣壳蛋白对诺如病毒抗原特性，受体结合功能以及宿主特异性起着重要的作用。同源重组在诺如病毒之间十分常见，这也是诺如病毒不断进化出多种基因型的方法。因此，进一步的研究将重点关注诺如病毒基因组的分子进化动向，为以后控制和预防诺如病毒导致的疫情爆发提供帮助。

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