麻疹病毒的感染性克隆研究

　　麻疹病毒属隶属于副黏病毒科副黏病毒亚科，共6个病毒成员，包括犬瘟热病毒（Canine distem-per virus,CDV）、麻疹病毒（Morbillivirus）、海豹瘟病毒（Phocine distemper virus,PDV）、牛瘟病毒（Rinderpest virus,RPV）、鲸类动物麻疹病毒（Ceta-cean morbillivirus,CeMV）和小反刍兽疫病毒（Pes-te-des-petits-ruminants virus,PPRV），核酸序列为不分节段单股负链RNA,基因长度为16kb左右，基因组含有6个基因，从3′端到5′端依次为N-P-M-F-H-L,依次编码核衣壳蛋白（nucleocapsid protein,N）、磷蛋白（phosphoprotein,P）、基质膜蛋白（ma-trix protein,M）、融合蛋白（fusion protein,F）、血凝蛋白（hemagglutinin,H）和大蛋白（large virus-spec-ified RNA polymerase protein,L），以及非结构蛋白V和C.麻疹病毒对人和动物危害极大，目前牛瘟病毒已被成功净化，其他病毒的净化工作还有待进一步加强，解决这一难题均可通过构建麻疹病毒属病毒全长感染性克隆来实现。

　　1反向遗传操作系统

　　文献资料显示，目前应用于不分节段负链RNA病毒的反向遗传系统主要有T7RNA聚合酶和RNA聚合酶Ⅱ反向遗传操作系统[1].

　　1.1基于T7RNA聚合酶的反向遗传操作系统

　　T7RNA聚合酶（T7RNA polymerase）是一种由T7噬菌体编码RNA聚合酶，长度为883个氨基酸，分子质量约99ku,专门催化5′→3′方向的RNA合成过程。启动子T7RNA聚合酶专一性强，即只会转录T7启动子下游的DNA.转录一旦开始，聚合酶就会沿着模板方向不断向前移动合成RNA,直至遇到终止子（terminator）序列为止，不再向新合成的RNA链继续添加核苷酸，从而新合成的RNA链便从DNA模板解离[2].基于T7RNA酶其转录具有严格的合成高效性和转录特异性的优点，广泛应用于麻疹病毒属病毒的全长cDNA转录载体的构建[3].T7RNA聚合酶细胞系的应用极大地提高了病毒的拯救效率，借助此细胞系转染含病毒基因组cDNA克隆和辅助表达质粒就可以实现病毒的拯救[4].将含有T7RNA聚合酶的真核质粒转染BHK-21细胞，通过使用新霉素加压筛选，获得一株稳定表达T7RNA聚合酶的细胞BSRT7/5,该细胞系已被广泛应用[5].也有学者将T7RNA聚合酶表达在猪肾细胞，完成了猪瘟病毒的拯救。

　　1.2基于RNA聚合酶Ⅱ的反向遗传操作系统

　　T7RNA聚合酶系统需要预先感染携带T7RNA聚合酶的重组痘病毒或转染能表达T7RNA聚合酶的特定细胞系，操作过程相对繁琐，且易造成外源病毒污染。为解决上述难题，国内外学者不断尝试建立一种仅借助于细胞内RNA聚合酶的拯救系统。

　　RNA聚合酶Ⅱ位于细胞核的核质内，蛋白分子质量为550ku,由12个亚基组成，负责合成mR-NA的前体。目前已成为应用较多的转录系统之一，商品化的真核转录载体的构建多该转录系统。

　　最常见的RNA聚合酶Ⅱ启动子为猿病毒40启动子和人的巨细胞病毒启动子。

　　RNA聚合酶Ⅱ的转录产物于3′末端被切断，经腺苷酸化后合成RNA,无明显的RNA转录终止信号[6].众多学者用含人、犬、棉鼠和羊等SLAM受体的真核质粒转染sf9、CHO、Vero、MDCK、CRFK、BHK-21和CV1等细胞，通过加压筛选，获得稳定表达SLAM的细胞系，该细胞系在分离病毒和反向遗传等领域被广泛应用[7-8].

　　2牛瘟病毒的感染性克隆

　　牛瘟虽已被消灭，但牛瘟病毒感染性克隆的研究在很大程度上推动了其他病毒的相关研究，为其他病毒的净化创造条件。

　　Baron M D等[9]克隆出具有精确末端的牛瘟病毒的全基因组序列，并通过可表达T7RNA聚合酶的重组痘病毒，成功拯救RBOK疫苗株。

　　Das S C等[10]通过制备嵌合的RPV（即PPRV的H或F基因取代RPV H或F基因），结果表明，当仅取代1个基因无法成功拯救病毒，同时取代2个基因，才能够成功拯救嵌合病毒，说明F和H基因同时存在方可成功拯救牛瘟病毒。

　　Parida S等[11]成功拯救出一种嵌合牛瘟病毒系统，结果显示，该嵌合体病毒在细胞培养维持高效率的复制，使用该嵌合疫苗接种的牛无不良反应。

　　Ban-yard A C等[12]于2010年成功拯救在RPV全基因组的P基因下游和M基因上游之间具有独立转录单元的EGFP基因的RPV,使用共聚焦显微镜即可完成RPV复制的检测。

　　3犬瘟热病毒的感染性克隆
　　
　　目前已成功构建Onderstepoort、A75/17、5804P、OS和neurovirulent Snyder Hill等病毒株的感染性克隆[13].

　　Gassen U等[14]利用T7RNA聚合酶系统成功拯救CDV Onderstepoort疫苗株，采用点突变技术于L基因的编码区突变2个碱基，实现拯救病毒和亲本病毒的区分。

　　Plattet P等[15]也构建出CDV A75/17株的感染性克隆，并将GFP成功插入CDV基因组，拯救出能够表达GFP的重组病毒。

　　von Messling V等[16]在研究中对重组病毒的细胞嗜性、融合特性和生长特性与亲本毒株比较后发现，影响CDV细胞嗜性和细胞致病性的主要决定因子不是病毒骨架。也有学者以驯化致弱后的犬瘟热病毒小熊猫株作为模板，成功拯救出CDV小熊猫株。近年来，国内外学者开展了大量CDV致病机理领域的研究工作，Ludlow M等[17]在构建CDV SH株感染性克隆的基础上，采用反向遗传学技术将EGFP或者红色荧光蛋白插入到CDV基因组中，用拯救的病毒感染雪貂，通过检测报告基因的表达，表明CDV感染动物以后能迅速突破血脑屏障进入脑脊液，并扩散到蛛网膜下腔，引起动物发生急性病毒性脑膜炎，进一步促进了患病动物体内病毒的传播路径的敏感性病理评估，成功构建出研究CDV传播机理和急性病毒性脑膜炎发病机理的新型模型。也有研究将序列比对，在CDV基因组M和F基因之间存在的非翻译区（UTR）具有较高的变异性，利用反向遗传技术将CDV不同毒株之间的M~F区段进行相互交换，发现这种改变并不影响病毒的毒力或者表型，证明该区段在功能上可以互换。

　　Rouxel R N等[18]将CDV的M、F、H与MV的反向遗传载体构建嵌合疫苗，由此产生的病毒没有引起雪貂疾病或免疫抑制，并具有一定的免疫保护作用。

　　4小反刍兽疫病毒的感染性克隆

　　小反刍兽疫病毒主要感染小反刍动物，表现为发热、口炎、腹泻和肺炎，在世界范围内广泛流行。

　　国外学者成功克隆PPRV的全基因序列，利用精确的3′和5′末端构建出的Tu/00株PPRV的微型基因组，并针对感染性克隆的启动子开展研究，结果表明，有效的微型基因组须包括顺式元件、反基因组的启动子和3个辅助性质粒（即N、P和L）。将全长分4段进行扩增，将基因内部酶切位点进行连接，并将报告基因eGFP插入P基因与M基因之间[19].

　　国内有学者将外源表位与N蛋白的羧基端融合，替代原始的N蛋白的辅助质粒，结果证明外源表位几乎不影响病毒的拯救，表明融合外源表位后对N蛋白的功能影响较小[20].在此基础之上，Yin C等[21]利用已构建的PPRV/N75/1株反向遗传操作系统，构建了表达亚洲1型FMDV-VP1蛋白的重组病毒，接种山羊和牛均可诱导产生PPRV和FMDV中和抗体，结果表明，针对亚洲1型FMDV强毒的攻击的具有免疫保护作用，说明PPRV/N75/1株作为活载体疫苗具备技术可行性。

　　Yunus M等[22]从病毒感染细胞中提取和纯化的核糖核蛋白复合物、N蛋白包裹的RNA模板和在昆虫细胞中表达的重组聚合酶复合物，并将这些成分组合在一起建立PPRV的体外转录系统，该系统可在体外持续转录所有蛋白的mRNA,表现出梯度转录特性。

　　Mu-niraju M等[23]利用体外转录的方法成功拯救Mo-rocco/2008.

　　Wang Z等[24]于西藏山羊体内首次检测并分离得到病毒，利用体外转录系统成功拯救了PPRV Tibet/Bharal/2008株。

　　5结语

　　反向遗传学已经广泛应用于生命科学研究的各个领域，对于病毒而言，借助分子生物学和基因工程技术，研究范围不断地拓展和延伸。麻疹病毒属成员的致病机理的研究相对复杂，反向遗传操作技术成为其致病机理研究的辅助工具。麻疹病毒属病毒的感染性克隆经过几十年的研究已取得一定进展，特别是针对麻疹病毒的致病机理和病毒载体方面的研究更加深入[25].其中MV的研究最为深入，研究人员从多个方面采用不同的方法就H蛋白对病毒增殖的影响开展了研究，并利用重组病毒针对新发现的关键位点进行了验证。相对于MV而言，CDV与PPRV的研究相对滞后，尤其针对PPRV的研究还需进一步深入。