病毒学论文
鹅细小病毒病又称小鹅瘟，其作为一种急性传染病给养鹅业造成了重大的经济损失，严重影响了养鹅业的健康发展。该病主要侵害 1 月龄以内的雏鹅，发病后主要表现为精神萎靡、食欲废绝、严重下痢和渗出性肠炎等症状[1].该病的病原为鹅细小病毒 （Goose Parvovirus,GPV），该病毒属于细小病毒科细小病毒属，GPV 仅有一个血清型[2],病毒粒径约 20 nm,是目前已知的动物病毒中较小、较简单的病毒之一[3].我国学者方定一于 1956 年首次在江苏扬州发现并命名为"小鹅瘟"[1].匈牙利学者德舍氏 （Derzsy's）于 1966 年首次使用鹅胚分离到该病毒；1974 年，世界家禽协会将其正式命名为 Derzsy's 病，随后 GPV 不断蔓延至中国台湾[4]、匈牙利[5,6]、英国[7]、日本[8]、泰国[9]、德国[10]、美国[11]、瑞典[12]和波兰[13]等多个国家和地区，给全球养鹅业造成了严重危害。本研究从江苏省各市鹅场病死雏鹅的肝、脾、肠病料中分离到 5 株病毒。通过实验室诊断证明所分离的 5 株野外病毒均为小鹅瘟病毒，本研究中同时对该 5 株 GPV 的 VP3 基因进行序列测定并进行了系统的遗传进化分析。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料
江苏省各市鹅场死亡的，具有小鹅瘟典型病变的雏鹅肝、脾、肠病料组织，病料来源及分离时间见表 1.
1.1.2 种胚9 ~ 10 日龄 SPF 胚购自北京梅里亚 SPF 种禽场；鹅胚购自高邮市非免种鹅场。
1.1.3 抗原与血清
GPV 琼扩标准抗原、阳性血清均由本研究中心制备。
1.1.4 试剂及仪器
Taq 酶、RNA 酶、氨苄青霉素、IPTG、X-gal、dNTP、DNA marker、pEASY-T3 Cloning Kit 和胶回收试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；EDTA、Tris 碱、SDS 和蛋白酶K 购自 Sigma 公司；EcoR Ⅰ限制性内切酶购自 Fermentas 公司；其他试剂均为国产分析纯级；PCR 扩增仪为美国 ABI 公司产品，型号为 GeneAmp PCR System 9700;高速冷冻离心机为美国 Sigma 公司产品，型号为 3K15;小鹅瘟病毒 VP3基因的特异性引物：P1:5'-CCAAGCTACAACAACCACAT-3'和P2:5'-TGAGCGAACATGCTATGGAAGG-3',目的条带大小为539 bp.
1.2 方法
1.2.1 病毒分离及传代
取具有典型病变鹅的肝、脾、肠组织，剪碎，按1 ∶ 3 加入灭菌 PBS 溶液，研磨，匀浆，经超声波处理后，5 000 r/min 离心 15 min,反复冻融数次，取上清液加青、链霉素双抗至 2 000 U/mL 和 2 mg/mL,接种非免疫鹅胚，0.2 mL/枚，置38 ℃孵育。收取72 h后死亡鹅胚的尿囊液，分装成若干青霉素小瓶，每瓶 1 mL ~ 2 mL,-70 ℃冷冻保存备用。每代设不接种的正常鹅胚作对照。传代时尿囊液均作 1 ∶ 100 稀释，分别接种 6 ~ 8 枚鹅胚，每胚 0.2 mL,取 72 h ~ 120 h 之间死亡的鹅胚尿囊液。
1.2.2 琼脂扩散试验 （AGP）
按照参考文献所述的方法进行抗原纯化浓缩，取死亡胚尿囊液，经 6 000 r/min 离心 20 min 弃沉淀，加等量氯仿混合，6 000 r/min 离心 30 min 取上清，经 PEG 6000弃沉淀浓缩 20 倍后制成待检抗原[14].参照《兽医微生物实验指导》中的方法进行琼脂扩散试验[15].简述之，在琼扩板周围孔加入不同稀释度的标准抗小鹅瘟病毒阳性血清，中心孔依次加入标准抗原、待检病毒分离物和正常鹅胚尿囊液。
1.2.3 红细胞凝集试验
根据前述方法将病毒液进行纯化后浓缩 2 倍制备待检病毒液。将待检病毒液用磷酸盐缓冲液在"U"型板中进行 2 倍连续倍比稀释，每孔 25 μL,最后 1 孔加相同体积的磷酸盐缓冲液作对照。随即向各孔内加入 25 μL 的1 %各种动物的红细胞，充分混匀，37 ℃放置 15 min 后检查结果。
1.2.4 病毒基因组提取
按照参考文献[4]所述的方法提取 GPV 各分离株的基因组，简述之：500 μL 尿囊液与裂解缓冲液 （ 含有 pH 8.0的 50 mM 的 Tris,5 mM EDTA,2 % SDS 和 200 μg/mL的蛋白酶 K） 等体积的混合，完全混匀后使用等体积的酚氯仿 （ 苯酚∶氯仿 =1 ∶ 1） 抽提两次，12 000 r/min 离心10 min 后吸取上清使用两倍体积的无水乙醇进行沉淀，-20 ℃放置 10 min 后 12 000 r/min 离心 10 min 后弃上清，使用 70 %的酒精溶液清洗沉淀后 TE 缓冲液溶解，-20 ℃保存备用。
1.2.5 鹅细小病毒 VP3 基因的扩增及序列测定
以提取的基因组 DNA 为模板、P1、P2 为引物扩增 VP3基因片段。反应条件如下：94 ℃预变性 3 min;94 ℃变性 30 s,55 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 30 s,30 个循环；最后进行 72 ℃延伸 5 min.PCR 产物经 1 %琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。目的 DNA 片段与 TA 克隆载体相连后，经转化、挑斑、摇菌、质粒提取及鉴定后，将含有重组质粒的阳性克隆斑送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。
1.2.6 小鹅瘟病毒 VP3 基因遗传进化分析
将测序结果进行 BLAST 搜索后，下载并整理了 107 株小鹅瘟病毒及 19 株番鸭细小病毒 VP3 基因的序列数据。
使用 Lasergene7.1 软件包中的 Meaglin 软件进行比对，然后使用 BioEdit 软件进行序列整理，最后对比对后的序列进行遗传进化分析。遗传进化树利用 MEGA 6.0 软件中的最大似然法进行构建，软件预测最佳替换模式为 K2+G.
2 结果
2.1 病毒分离
鹅胚接种后，多数胚死亡时间在 60 h ~ 120 h 之间，未接种的对照鹅胚均健康存活。与对照鹅胚相比，感染胚可见绒毛尿囊膜增厚，胚胎发育阻滞，胚体全身严重出血，胚头充血严重 （ 图 1）；多数胚胎的心、肝、肾有出血，少数胚胎的心肌苍白。
2.2 琼脂扩散试验 （AGP） 结果
琼脂扩散试验结果表明，用死亡鹅胚尿囊液制备的病毒浓缩抗原能与 GPV 阳性血清发生沉淀反应，并与小鹅瘟诊断抗原和阳性血清形成的沉淀线吻合。
2.3 红细胞凝集试验结果
所有 5 株病毒分离物均不凝集鸡、鸭、鹅、豚鼠及兔子的红细胞。
2.4 PCR 鉴定结果
GPV 各分离株 VP3 基因扩增产物经 1 %琼脂糖凝胶电泳分析，均可见约 539 bp 的目的条带，DNA 大小与预期的结果相符 （ 图 2），结果表明这 5 株病毒分离物中均有 GPV.经鸡胚接种实验、琼脂糖扩散实验及 PCR 检测实验充分证实了这 5 株病毒分离物均为 GPV,并将 1 ~ 5 号病毒分离物分别命名为 Gooseparvovirus/nanjing/09、Goose parvovirus/taizhou/12、Goose parvovirus/nantong/12、Goose parvovirus/yangzhou/08、Goose parvovirus/yangzhou/11.
2.5 小鹅瘟 VP3 基因遗传进化分析结果使用 MEGA5.0 遗传进化分析软件构建的 ML 进化树见图 3,从遗传进化树来看，GPV 与 MDPV 分布在不同的两个分支，这符合该病毒属一般规律[16,17].而 GPV 又进一步演化为 3 个分支。本研究中 5 株 GPV 分离株中有 4 株处于国内主要分支上，仅有 1 株（Goose parvovirus/yangzhou/11） 与当前市售活疫苗在同一分支。该结果表明随着 GPV病毒在野外的不断遗传变异，该病毒在不断的进化演变，从而出现了较新的基因型。
3 讨论
本研究通过分离及鉴定获得了 5 株 GPV 野外分离株，并对这 5 株 GPV 进行了系统遗传进化分析。实验结果表明国内主要分支已逐渐形成了新的基因亚型，并且与中国台湾的主要分离株具有较近的亲缘关系。但中国台湾因其与大陆相分离的特点，也逐渐出现了与内陆不同基因型的分支，其与波兰、美国、匈牙利、德国、英国及法国形成了国外分支。市售活疫苗为 1961 年从中国大陆分离到的野毒经多次传代致弱而来，但从当前病毒分离及遗传进化分析结果来看，该分支已逐渐淡去其主要流行的特点，本研究中于 2011 年分离到的一株病毒是该分支最晚分离到，其他市售疫苗分支上的分离株的分离年代均较久远。根据基因型越相近其免疫保护效果越确实的一般规律[18],我们分析认为如果使用国内主要分支上的流行株作为疫苗候选株进行疫苗的开发，更具有生物学意义。