miR-34a在肿瘤中的作用及其相关EMT机制

　　关键词：　microRNA-34a; 微RNAs; 上皮-间充质转化; 肿瘤细胞; 竞争内源性RNA; 综述;

　　microRNAs(miRNAs)是一类高度保守的单链非编码RNA,长度只有20～24个核苷酸。它们可以与mRNAs的3'非翻译区域(untranslated regions, UTR)结合,抑制信使RNA(mRNA)翻译,或诱导mRNA降解或脱腺苷化,从而在转录后沉默基因表达[1]。miRNAs通过调控靶基因表达,参与多种信号传导途径,调控包括细胞增殖、转移、凋亡、衰老、分化、自噬和免疫反应等诸多生物学过程[2],并与肿瘤等疾病的发生、发展密切相关[3]。miRNAs可能发挥肿瘤抑制因子或癌基因作用[4]。miRNA 34a(miR-34a)作为miR-34家族成员[5],是首个被证实受p53直接调控的miRNA[6]。miR-34a在大肠癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌和骨肉瘤等组织中均有异常表达。许多研究表明,miR-34a作为一种生物学标志物,可用于肿瘤的诊断和预后判断[7,8]。原发肿瘤细胞可通过上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)获得迁移和侵袭能力,导致肿瘤转移[9,10]。miR-34a可通过EMT而影响肿瘤转移。近年来研究表明,mRNA、环状RNA(circRNA)、伪基因转录本和长链非编码RNA(LncRNA)等通过microRNA反应元件调节相互表达,从而竞争性结合miRNAs,即竞争性内源RNA(ceRNA)机制[11]。本文就miR-34a在肿瘤中的作用及其相关EMT机制,尤其是ceRNA机制在调节miR-34a及EMT中的作用做一综述。

　　1、 miR-34a调控肿瘤细胞EMT导致肿瘤转移

　　大多数肿瘤细胞通过EMT获得转移和侵袭能力,导致肿瘤转移[12]。通过EMT过程,上皮细胞失去了形态和黏附能力,并获得了间质表型[13]。EMT的特点是使细胞失去极性,一些上皮标志物如钙黏附蛋白E、细胞角蛋白和α-连环蛋白表达减少,而一些间质标志物如神经型钙黏附蛋白、波形蛋白、纤维连接蛋白和基质金属蛋白酶表达增加[9,12,13]。

　　EMT产生具有侵袭性的细胞,使它们能进入血液,并经全身转移到其他器官。EMT是肿瘤进化过程中的重要过程,为肿瘤细胞提供适合生存的微环境。适当的细胞环境、细胞因子和细胞外信号可诱导EMT[14]。miR-34a对肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭有负性调控作用[15,16]。研究表明,使用多西环素诱导pri-miR-34a表达可致人结肠癌细胞SW480中波形蛋白下调和E-cadherin上调,提示miR-34a可负性调节EMT以抑制癌细胞增殖和侵袭[17]。
 

　　2 、miR-34a调控EMT的作用机制

　　2.1 、miR-34a与EMT诱导转录因子(EMT-transcription factors, EMT-TFs)的3′-UTR结合调控EMT

　　一项使用多西环素诱导pri-miR-34a表达的研究发现,除EMT标记的表达变化外,还观察到EMT-TFs的变化,提示其对肿瘤相关EMT的激活是必不可少的[18]。miRNAs可与EMT-TFs结合,从而形成双负反馈环来干扰肿瘤相关的EMT[19]。与miR-34a相关的EMT-TFs有如下3种:①锌指转录因子SNAIL家族,包括SNAIL1、SNAIL2和SNAIL3;②ZEB转录因子,包括ZEB1和ZEB2;③基本螺旋-环状-螺旋转录因子家族,包括TWIST1、TWIST2和E12/E47[20,21]。miR-34a直接与EMT-TFs的3′-UTR结合,调节肿瘤相关的EMT。SNAIL 3′-UTR含有与miR-34匹配的保守序列[17,22]。SNAIL家族是唯一与所有3个miR-34家族成员(miR-34a/b/c)具有匹配序列的EMT-TFs,进一步研究证实SNAIL是miR-34家族的直接靶标[22]。除了SNAIL家族外,其他EMT-TFs(如ZEB1、ZEB2和TWIST1)的3′-UTR也存在与miR-34a匹配的保守序列以及干性因子BMI1、CD44、CD133和c-MYC,这些干性因子通过与miR-34a直接结合而表达降低[5]。

　　2.2、 miR-34a通过p53调控EMT

　　p53失活或突变是因抑制SNAIL1的表达和活性,进而促进肿瘤细胞发生EMT[22]。p53激活则通过诱导miR-34a/b/c下调SNAIL表达,抑制miR-34a/b/c则致SNAIL上调,细胞呈EMT标记的改变和相关特征,从而增强细胞迁移和侵袭能力。miR-34a异位表达诱导EMT,下调SNAIL表达[17]。故p53、SNAIL1和miR-34形成反馈回路以控制肿瘤细胞产生EMT[22]。

　　2.3 、miR-34a通过靶向TP53和MDM4诱导p53激活

　　除了p53调节miR-34a的表达外,miR-34a还通过直接靶向TP53和MDM4来诱导p53激活。TP53和MDM4是p53反式激活抑制剂[23]。miR-34a通过靶向多种p53抑制剂来激活p53的功能,从而从表观遗传学角度提高p53的转录活性[24]。miR-34a对p53网络的正负效应的复杂性表明,miR-34a不是简单地促进p53反应,而是可能促进p53对遗传毒性应激反应的稳定性[23]。与p53野生型细胞相比,p53突变的卵巢癌细胞miR-34a表达下调[25]。当细胞用p53化学激活剂Nutlin-3a处理时,miR-34a的表达显着增加[26]。这表明miR-34a是p53的下游靶点。更重要的是,p53通过增强miR-34a的表达来调节SNAIL的表达和活性,从而减少EMT[22]。总之,miR-34a、p53和EMT形成了一个复杂的网络,以影响彼此的功能[16]。

　　2.4 、miR-34a经Wnt、TGF-β1/Smad3/4、Notch信号传导途径调控EMT

　　miR-34a不仅可经调控EMT-TFs和抑癌基因p53,还可经Wnt[27]、TGF-β1/Smad3和Notch1等信号传导途径调控EMT[28]。

　　2.4.1、 Wnt信号传导通路:

　　研究表明,miR-34a可通过调节正常乳腺和乳腺癌细胞中的多途径相关基因负性调控Wnt的转录活性[29]。淋巴增强因子1(LEF1)是Wnt信号传导通路中的重要转录因子,参与细胞增殖和侵袭的调控。miR-34a经调节LEF1表达来调控前列腺癌细胞EMT,并与前列腺癌细胞迁移和侵袭呈负相关。同样,miR-34a可能经特异性抑制LEF1调控前列腺癌的EMT过程[30]。miR-34a经抑制膀胱癌TCF1/LEF1轴而促进人膀胱癌阿霉素耐药株的化疗敏感性[31]。HOX转录反义RNA(HOX transcript antiense RNA, HOTAIR)是一种高度丰富和保守的反义RNA,参与包括胃癌对顺铂的耐药性在内的许多重要生物学过程,敲除HOTAIR经上调miR-34a抑制顺铂耐药,提示HOTAIR/miR-34a轴对胃癌细胞的作用涉及PI3K/Akt和Wnt/β-catenin信号传导通路[32]。

　　2.4.2 、Notch信号传导通路:

　　除了EMT-TFs外,miR-34a还可以通过与关键靶基因结合来调节EMT。例如,miR-34a可以与结肠癌细胞和宫颈癌细胞中Notch1和Jagged1的3'-UTR结合,从而抑制细胞迁移能力,并抑制波形蛋白和纤维连接蛋白的表达,促进E-cadherin的表达[28]。miR-34a通过调节与耐药性相关的靶基因JAG1和Notch1来减弱对紫杉醇的耐药性。NFIX环状RNA通过Notch信号传导通路特异性结合miR-34a-5p来调控Notch1的表达,进而促进胶质瘤的进展[33]。

　　2.4.3、 转化生长因子-β1(TGF-β1)及其他信号传导通路:

　　TGF-β1是一种影响同一细胞自分泌或邻近细胞旁分泌的分泌蛋白,具有促瘤或抑瘤作用。有研究证实miR-34a可通过抑制鼻咽癌细胞Smad4的表达,逆转转化生长因子-β诱导的鼻咽癌细胞的侵袭和迁移[34]。白细胞介素-6受体(IL-6R)作为miR-34家族成员的靶点,可介导信号传导和转录激活因子3(STAT3)的激活,而STAT3则通过保守的结合位点与miR-34a结合,抑制miR-34a的表达,而这种抑制作用是白细胞介素-6诱导的EMT和侵袭所必需的[35]。因此,IL-6R/STAT3/miR-34a构成了调控EMT以抑制肿瘤进展的反馈环。

　　3 、ceRNA-miR-34a调控的新机制

　　ceRNA假说最初于2007年由Ebert等人提出,该假说认为mRNA、circRNA、伪基因转录本和LncRNA通过microRNA响应元件(microRNA responsive element, MRE)调控相互之间的表达,以竞争性结合miRNAs,目前已有大量研究支持该假说[11,36]。

　　LncRNA是指长度超过200个核苷酸的RNA,本身不编码蛋白质,与包括肿瘤在内的多种疾病有关。研究发现,Lnc015192及其靶基因Adam12通过ceRNA机制特异性结合miR-34a,促进乳腺癌转移。敲除miR-34a后,Adam12和Lnc015192显着上调,而敲低Adam12和Lnc015192则抑制乳腺癌细胞的迁移、侵袭和EMT。进一步的实验表明,Lnc015192通过作为miR-34a的ceRNA调控靶基因Adam12的表达[37]。SNHG7是另一种通过调节miR-34a促进肿瘤生长和EMT的LncRNA[38]。进一步研究发现SNHG7作为ceRNA,通过结合miR-34a增加大肠癌GALNT7的表达,即通过与内源性miR-34a竞争,调控PI3K/Akt/mTOR通路,促进细胞增殖和转移从而发挥致癌作用[39]。LncOC1通过结合miR-34a和另一miR-34c,促进卵巢癌细胞的增殖和迁移[40]。

　　circRNA是最近发现的另一种新型RNA,不同于众所周知的线性RNA,它形成一个共价闭合的连续环。通常circRNA分子中的3′和5′端连接在一起。内源性circRNA对核酸外切酶介导的降解具有抗性,鉴于其5′或3′端的缺失,可能比细胞中的大多数线性RNA更稳定[41]。circRNA在细胞质中富集,并与其线性mRNA广泛互补,显示了这些RNA可能通过结合microRNA发挥其功能。因此,circRNA在基因调控中具有潜在的重要作用[41]。研究发现,circRNA可以调节EMT,这表明一些circRNA可能影响EMT相关的细胞功能,包括癌变和转移[42]。最近研究表明,circRNA在肿瘤中起到miR-34a分子海绵的作用。circGFRA1和GFRA1在三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)中可能通过调节miR-34a发挥作用[43]。miR-34a也被证明可直接抑制大肠癌和乳腺癌中的乳酸脱氢酶A(LDHA)的表达[44],以及肺癌和急性髓细胞白血病中重要的免疫检查点抑制剂PDL1的表达[45]。进一步研究表明,PDL1和LDHA均是通过调节miR-34a来促进TNBC细胞增殖和转移的ceRNA[46]。因此,同时针对PDL1和LDHA的靶向治疗,可能为乳腺癌特别是TNBC开辟一条新的治疗途径。另一种circRNA circNFIX通过Notch信号传导通路竞争性结合miR-34a-5p,以调节Notch1,最终促进胶质瘤的进展[33]。与正常脑组织相比,circNFIX在胶质瘤中过度表达,Notch信号传导通路在肿瘤组织中的表达明显上调。Si-circNFIX和miR-34a可促进细胞凋亡,而miR-34a抑制剂可抵消Si-circNFIX对胶质瘤细胞的抑制作用。体内实验进一步表明,Si-circNFIX通过调节miR-34a和Notch信号传导抑制胶质瘤细胞的生长[33]。总之,ceRNA通过特异性吸附miR-34a来调控基因表达,并在肿瘤发生、发展和EMT中发挥重要作用。

　　4 、问题与展望

　　miR-34a作为肿瘤相关EMT的重要负性调节因子,在抑制肿瘤发生及转移方面发挥着相当重要的作用。miR-34a是一种很有前途的肿瘤抑制因子,而关于miR-34a的临床前期研究证实了其肿瘤抑制作用机制。随着miR-34a疗法的逐步应用,也出现了一些问题。首先,miRNA降解会阻止miR-34a穿透毛细血管内皮进入靶细胞。其次,miR-34a的免疫反应也值得重视。一项名为NCT02862145的临床试验由于发生了5次miR-34a免疫相关不良事件而被终止。如果miR-34疗法使用纳米载体,那么纳米粒子的毒性也值得商榷。再者,miR-34a治疗效果不佳的原因可能与EMT或肿瘤基因信号传导过程中,抑制肿瘤细胞miR-34a再表达有关,而miR-34a在正常细胞中的异常表达则可能是产生系统性不良反应的基础。ceRNA的作用机制涉及mRNA、circRNA、伪基因转录本和LncRNA表达的相互调节,在EMT过程中竞争性结合microRNA。因此,miR-34a和EMT之间的通路网络可能作为重要的生物学标志物或是精准治疗靶点,为恶性肿瘤诊断与治疗开辟了新的道路。

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