临床中多种慢性气道炎性反应疾病( 如 COPD、哮喘等) 往往伴有支气管收缩及重塑产生的气道狭窄，由此引发气道内压力增高，气道壁上皮细胞受压增加。而黏液高分泌作为这类疾病的突出病理表现，是疾病发生、发展及预后的重要影响因素。
黏蛋白5AC( MUC5AC) 是气道上皮尤其是病理状态下的主要黏蛋白表型，在气道黏液高分泌疾病中最具代表性。黏着斑激酶( focal adhesion kinase，FAK) 能介导机械牵拉所导致的 EＲK1 /2 活化。而 EＲK1/2 是已知的多种刺激因素诱导 MUC5AC表达和杯状细胞化生的关键性酪氨酸激酶。那么，FAK 是否在机械压力诱导的气道黏液分泌的信号传导通路中起作用呢? 该研究中以 FAK 为切入点，研究机械压力作用于气道上皮细胞所产生的对气道黏液分泌的调控作用及信号传导机制，以期探明机械压力在气道黏液高分泌调控机制中作用及其分子机制，为控制疾病状态下气道收缩狭窄状态提供新的思路。
1 材料与方法
1. 1 主要试剂及材料
正常人气道上皮 NHBE 细胞和 BEBM 培养基( 均 Clonetics 公司) ; DMEM 培养基( Mediatech 公司) ; Transwell 培养板( Corning 公司) ; ＲPMI 培养基、胎牛血清、TＲIzol 试剂和抗 β-肌动蛋白的单克隆抗体( Sigma 公司) ; 脂质体 Oligofectamine( Invitro-gen 公司) ; 鼠抗 MUC5AC 45M1 单克隆抗体 ( Neo-marker 公司) ; 鼠抗 FAK 单克隆、鼠抗 FAK 磷酸化位点多克隆( 抗 FAK Tyr397) 抗体、鼠抗磷酸化细胞外信号调节激酶 1/2( p-EＲK1/2) 单克隆抗体、表皮生长因子受体( EGFＲ) 阻断剂 AG1478、p-EＲK1/2抑制剂 PD98059( Cell Signaling 公司) ; PrimeScriptＲT 试剂盒 ( 大连宝生物公司) ; FastStart UniversalSYBＲ Green Master( Ｒox) ( 德国罗氏公司) ; 引物由( 上海生工公司合成) ; FAK siＲNA 和对照 siＲNA( Dharmacon 公 司) ，FAK siＲNA 序 列 为: FAK1，NNGCAUGUGGCCUGCUAUGGA; FAK2，UUUGGCGGUUGCAAUUAAATT。
1. 2 方法
1. 2. 1 细胞培养: NHBE 细胞接种于组织培养瓶中，加入支气管上皮细胞培养液，置于 37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱孵育，常规换液培养，当细胞汇合达 70% ～ 80% 时传代，将培养好的 2 代或 3代细胞接种到 Transwell 培养板中的多微孔聚碳酸酯膜上。Transwell 培养板插入配套 6 孔板中，形成上、下室，加入 1: 1 混合的支气管上皮细胞培养液/达尔伯克必需基本培养基混合培养液继续培养，上、下室培养液相同。每 2 天更换培养液至细胞长满纤维膜并融合，去掉上室培养液，建立气液相界面供试验使用，继续每 2 天更换下室培养液。
1. 2. 2 压力实验装置及分组: 参照文献［7 － 8］。Tr-answell 培养板上室加上带进气口的硅胶塞形成密闭小室，进气口连接气泵，通过向上室内输送湿化的37 ℃ 、5% CO2的空气，控制上室气压，而下室仍处于大气压，从而使得多微孔聚碳酸酯膜上的NHBE细胞受到跨细胞压力。参照文献［1，8］，气液相界面培养14 d开始，采用 30 cm H2O 压力作用于 NHBE 细胞，每天1 h，连续7 d，模拟慢性气道炎性性疾病中气道收缩时气道上皮细胞受到的慢性机械压力。
1. 2. 3 细胞分组: 将形成气液相界面的 NHBE 细胞分组处理: 1) 空白对照组: 无血清培养基继续培养，不予任何刺激; 2) 机械压力组: 细胞每天予以 30 cmH2O 压力作用 1 h，连续 7 d; 3) 转染 FAK siＲNA 对照组; 4) 机械压力 + 转染 FAK siＲNA 组。
在探讨 EＲK1/2 在机械压力诱导的 MUC5ACmＲNA 及蛋白表达中的作用实验中，采用 EＲK1 /2特异性抑制剂 PD98059 作为干预因素，将细胞分为以下 4 组: 空白对照组、机械压力组、PD98059 对照组和 PD98059 + 机械压力组。
在探讨 FAK siＲNA 联合 EGFＲ 特异性抑制剂AG1478 对机械压力诱导的 MUC5AC mＲNA 和蛋白表达的影响的实验中，将细胞分为以下 6 组: 空白对照组、机械压力组、AG1478 对照组、AG1478 + 机械压力组、FAK siＲNA + AG1478 对照组和 FAK siＲNA+ AG1478 + 机械压力组。
1. 2. 4 FAK siＲNA、对照 siＲNA 转染: 在转染前 1天将处于指数增长期的 NHBE 细胞按( 1 ～ 2) ×106个/mL的浓度在无血清条件下接种到培养板中，待细胞融合至 40% ～ 50%时进行转染。操作步骤按照脂质体 Oligofectamine 说明书进行。参照文献【9】，将 FAK siＲNA 与 Plus Ｒeagent 在 Opti-MEM 培养液中结合。用 Opti-MEM 培养液稀释的脂质体以10 μg / mL 的浓度进行转染。转染 6 ～ 8 h 后，将0. 5 倍容积的含 20% 血清的 ＲPMI 培养液加入到细胞中继续转染 48 h。转染后 24 ～ 48 h 于荧光显微镜下观察荧光，以此鉴定转染是否成功及转染效率。
1. 2. 5 实时荧光定量 PCＲ 检测 MUC5AC mＲNA 的表达: 细胞总 ＲNA 提取及浓度、纯度鉴定按参考文献［10］方法进行。cDNA 反转录按照 PrimeScript 反转录试剂盒说明书进行。人 MUC5AC( AF015521)引物序列为: 上游5'-CTGGACATGACCTGTTACAGC-3'，下 游 5'-AGCTGGCCTTCTTGTGCACGC-3'。 人GAPDH ( NM _ 002046 ) 引物序列为: 上游 5'-TGTTCGTCATGGGTGTGAACC-3'，下游 5'-CATGAGTCCTTCCACGATACC-3'。按照试剂盒说明建立 10 μLPCＲ 反应体系，反应参数为 95 ℃ 变性 10 min，95 ℃变性 15 s，55 ℃退火 30 s，40 个循环。采用 2－ ΔΔCt的方法分析目的基因 mＲNA 的相对表达量。Ct 是达到荧光阈值所需的循环数，ΔΔCt = 实验组( Ct 目的基因 － Ct 管家基因) － 对照组( Ct 目的基因 － Ct管家基因) 。
1. 2. 6 ELISA 法检测细胞分泌的 MUC5AC 蛋白含量: 按参考文献［11］方法进行。
1. 2. 7 Western blot 检测 FAK、p-EＲK1 /2 蛋白表达: 步骤按参考文献［11］方法进行( 鼠抗 FAK 单克 隆、鼠 抗 FAK 磷 酸 化 位 点 多 克 隆 ( 抗 FAKTyr397) 抗体、鼠抗 p-EＲK1 /2 单克隆抗体终浓度均为 1∶ 1 000) 。
1. 3 统计学分析
采用 SPSS17. 0 统计软件包，所有数据均以均值± 标准差( x ± s) 表示，两样本均数间比较采用 t 检验，多样本均数间比较采用单因素方差分析。
2 结果
2. 1 FAK siＲNA 转染对 NHBE 细胞合成 FAK 蛋白的干扰效率
FAK1 和 FAK2 siＲNA 转染组细胞表达 FAK 蛋白相对含量分别为( 0. 28 ±0. 03) 和( 0. 32 ±0. 04) ，均显着低于对照 siＲNA 组的( 0. 68 ± 0. 06) ( P ＜0. 01) 和未转染对照组的( 0. 74 ± 0. 07) ( P ＜ 0. 01)( 图 1) 。由于 FAK1 siＲNA 和 FAK2 siＲNA 均有显着干扰效率，故在后续实验中采用两者结合的一个siＲNA 来进行 ＲNA 干扰。
2. 2 机械压力对 FAK 磷酸化的影响
机械压力组细胞表达 FAK 磷酸化位点 Tyr397蛋白相对含量( 0. 39 ±0. 03) 较空白对照组的( 0. 25 ±0. 02) 有显着提高( P ＜ 0. 05) ( 图 2) 。
2. 3 FAK 在机械压力诱导的 MUC5AC mＲNA 及蛋白表达的影响
与空白对照组相比，机械压力能显着升高MUC5AC mＲNA 及蛋白含量( P ＜ 0. 01) ; FAK siＲNA转染则可显着降低由机械压力所诱导的上述指标的升高( P ＜0. 05) ; 但是，机械压力 + 转染 FAK siＲNA组细胞表达 MUC5AC mＲNA 及蛋白水平较转染 FAKsiＲNA 组仍然是增加的( P ＜ 0. 05) ( 表 1) 。
2. 4 FAK 在机械压力诱导的 EＲK1 /2 磷酸化中的作用
与空白对照组的( 0. 43 ±0. 07) 相比，机械压力组细胞 p-EＲK1/2 蛋白表达相对含量( 0. 79 ±0. 05)显着增加( P ＜0. 01) ; 与机械压力组相比，机械压力+ 转染 FAK siＲNA 组细胞表达 p-EＲK1 /2 蛋白相对含量( 0. 60 ±0. 04) 显着减少( P ＜0. 05) ; 但是，与转染 FAK siＲNA 对照组的( 0. 41 ±0. 02) 相比，机械压力 + 转染 FAK siＲNA 组细胞表达 p-EＲK1/2 蛋白相对水平仍然是增加的( P ＜0. 05) ( 图 3) 。
2. 5 EＲK1 /2 在机械压力诱导的 MUC5AC mＲ-NA 及蛋白表达中的作用
PD98059 + 机械压力组细胞 MUC5AC mＲNA 及蛋白相对表达水平与机械压力组相比显着降低( P ＜0. 01) ( 表 2) 。
2. 6 FAKsiＲNA 联合 EGFＲ特异性抑制剂AG1478 对机械压力诱导的 MUC5AC mＲNA 和蛋白表达的影响FAK siＲNA 联合 AG1478 能够显着抑制单纯机械压力诱导的 MUC5AC mＲNA 和蛋白表达( P ＜0. 01) ; AG1478 单独作用可显着降低由机械压力所诱导的上述指标的升高( P ＜ 0. 05) ，但与 AG1478对照组相比差异仍具有显着性( P ＜0. 05) ( 表 3) 。
3 讨论
FAK 在机械牵拉所导致的 EＲK1 /2 活化中起重要介导作用。而 EＲK1 /2 是已知的多种刺激因素诱导 MUC5AC 表达和杯状细胞化生的关键性酪氨酸激酶。因此，FAK 可能在机械压力诱导的气道上皮细胞 MUC5AC 表达中起信号传导作用。
该研究发现，机械压力能够诱导人支气管上皮细胞 FAK 最重要的自身磷酸化位点-酪氨酸位点Tyr397 的磷酸化水平增高。小干扰 ＲNA( small in-terfering ＲNA，siＲNA) ，可以序列特异性与靶 mＲNA序列结合，导致特异性 mＲNA 的降解，从而稳定持续地维持较长时间的基因沉默。该研究中所采用的 FAK siＲNA 质粒在实验中被证实可特异性地成功下调 NHBE 细胞 FAK 蛋白的表达。研究同时发现，机械压力能够诱导 NHBE 细胞 MUC5ACmＲNA和蛋白及磷酸化 EＲK1 /2 蛋白的表达显着增加，FAK siＲNA 则能够有效降低但却不能完全抑制机械压力诱导的上述效应，而 EＲK1/2 特异性抑制剂 PD98059 却能显着并完全抑制机械压力诱导的MUC5AC mＲNA 和蛋白的表达，提示机械压力诱导的 MUC5AC 高表达的信号传导通路为 EＲK 依赖的，FAK 为 EＲK 的上游信号分子，但可能存在其他非 FAK 依赖的 EＲK 激活信号通路。
支气管收缩产生的气道压力增加可经表皮生长因子受体( epidermal growth factor receptor，EG-FＲ) 信号通路完成细胞外机械信号向细胞内化学信号传导，并参与调节丝分裂原激活的蛋白激酶( mitogen-activated protein kinase，MAPK) 信 号 通路。因此，EGFＲ 可能是诱导 EＲK 活化并最终导致 MUC5AC 表达增加的另一上游机械传导通路。
在后续的实验中发现，EGFＲ 特异性抑制剂 AG1478与 FAK siＲNA 一样单独作用于 NHBE 细胞时能够显着降低但却不能完全抑制机械压力诱导的MUC5AC mＲNA 及蛋白的表达，而将两者联合作用于 NHBE 细胞则能完 全 抑 制 机 械 压 力 诱 导 的MUC5AC 的高表达，同时，EＲK 传导通路上游部分的 EGFＲ 的活化在各种因素诱导的气道黏液高分泌信号传导通路中居中心地位，因此，EGFＲ 为另一重要的机械压力诱导的 EＲK 激活及 MUC5AC 表达的上游信号通路。
研究结果初步证实了 FAK、EGFＲ 所介导的机械压力促人支气管上皮细胞 MUC5AC 表达效应，并进一步阐明了 EＲK 信号传导通路在其中所起的作用，从而加深了对气道黏液高分泌的机械传导机制的了解，为慢性气道炎症性疾病防控提供一个新的研究思路。
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