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多氯联苯作用于胎鼠神经干细胞的机制研究

来源:未知 作者:傻傻地鱼
发布于:2014-08-06 共3893字
论文摘要

  多氯联苯 (polychorinated biphenyls,PCBs) 是一种全球性环境污染物,对生物体可产生严重的毒害作用,尤其是对发育过程中的胎儿更为敏感,可导致运动失调、脑损伤、发育迟缓、智商降低等神经毒性.PCBs 的神经毒性机制尚不清楚,可能通过调节基因表达而产生毒副作用.Neuronatin(Nna)t 是一种与脑细胞的发育和分化密切相关的基因,在胎儿期和幼年期脑发育最旺盛时高表达,而成人后表达量逐渐下调,其错误表达将导致大脑发育障碍的发生.PCBs 是否通过下调 Nnat 基因的表达,而影响胎儿神经系统的发育,本研究通过多氯联苯 Aroclor 1254 (A1254) 作用于胎鼠神经干细胞 (Neural stem cells, NSCs) 而探讨其作用机制.

  1、 材料与方法

  1.1 动物和主要试剂

  SD 孕鼠来自广州中医药大学动物实验中心,DMEM/F12、B27、EGF、bFGF 购自 Gibco 公司,胎牛血清购自杭州四季青公司, Nestin、Nnat 和β-actin 单克隆抗体购自 Abcam 公司,A1254 购自Sigma 公司,AxyPrep 总 RNA 小量制备试剂盒购自Axygen 公司,引物由上海生物工程技术服务有限公司合成,Annexin V-FITC/kit 细胞凋亡检测试剂盒购自 Caltag Laboratoyies 公司.

  1.2 方法

  1.2.1 胎鼠 NSC 的分离、培养 孕 12~14 d SD大鼠,颈椎脱臼处死.无菌条件下打开腹腔,取出胎鼠解剖脑组织,剪碎吹打制成单细胞悬液.加入含 B27 5 mL/L,EGF 20 μg/L,bFGF 20 μg/L,青霉素和链霉素 100 U/mL 的 DMEM/F12 无血清培养基中.将原代细胞 2×105个细胞 /mL 接种于 25cm2培养瓶中,置于 37 ℃、5%CO2培养箱中常规培养,每 5~7 d 传代 1 次.1.2.2 胎鼠 NSC 的鉴定 将单细胞悬液种植于培养皿中,置入多聚赖氨酸包被的玻片,分别用无血清培养基 (DMEM/F12/B27/bFGF/EGF) 和含血清培养基 (DMEM/F12+5%胎牛血清) 培养,观察其生长分化情况,分别于 12 h、2 d、7 d、14 d 进行Nestin 免疫荧光染色检测.玻片取出后 PBS 洗 3 次;4%多聚甲醛固定20~30 min,PBS 洗 3 次;0.2%Triton X-100 透化5 min,PBS 洗 3 次;5%BSA 室温封闭 30 min,加Nestin 单克隆抗体放在湿盒中 4℃过夜,PBS 再洗3 次;加 FITC- 兔抗鼠 IgG 二抗室温 30 min(注意避光),PBS 洗 3 次;95%甘油封片,然后放在荧光显微镜下观察.1.2.3 A1254 对 NSC 的 处 理 A1254 溶 解 于DMSO 中,将 NSC 细胞随机分成正常空白对照组、溶剂对照组 (培养基中 DMSO 浓度为 0.1%) 和 3组实验组 (培养基中 A1254 终浓度分别为 0.10ng/mL、1.00 ng/mL、10.00 ng/mL) .处理 72 h 后离心处理细胞备用.1.2.4 实时定量 RT-PCR AxyPrep 总 RNA 小量制备试剂盒提取总 RNA,用随机六聚体反转录合成 cDNA,扩增 Nnat 基因.Nnat 上游引物 5'TCCGGA ATT CAT GCT CCA CGA GTC CTA CTG 3',下游引物 5'ACG CGT CGA CAA ACT CTG AGT CTGGAC AAC 3',扩增产物为 260 bp;内参照 G3PDH上游引物 5'TGC CAC TCA GAA GAC TGT GG 3',下游引物 5'CAA CGG ATA CAT TGG GGG TA 3',PCR产物为 182 bp.反应体系为 25 μL,反应条件 94℃变性 30 s、58 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 30 s,30次循环后 72 ℃ 5 min 延长.1.2.5 Western blot 收集细胞用 PBS 洗 3 次,加SDS 蛋白裂解液放置在冰上裂解 30 min.转移至EP 管中,12 000 g×15 min 4℃,提取各组总蛋白,Bradford 的方法测定蛋白的含量.取 50 ug 样品,进行 SDS-PAGE 电泳分离;半干式电转到醋酸纤维素膜上,用含 5%脱脂奶粉室温封闭 1 h;加入Nnat 和 β-actin 抗体,4 ℃下孵育过夜;TBS 洗膜后与辣根过氧化物酶标记的 IgG 二抗室温孵育1h.洗膜后以化学发光法检测蛋白表达量.曝光底片应用凝胶成像系统进行扫描,用 Fluorchem 1.02软件对条带的灰度进行半定量分析,结果用目的蛋白的光密度与内参照的光密度的相对值来比较.1.2.6 细胞凋亡 用 PBS 洗涤 2 次细胞后,用稀释的结合缓冲液重悬为(2~5)×105/mL,195 μL细胞悬液加入 5 μL Annexin V-FITC 混匀,室温避光孵育 10 min,PBS 洗涤 1 次,再用 190 μL 结合缓冲液重悬,加入 10 μL PI,流式细胞仪检测.
1.3 统计学处理。

  计量资料以均数±标准差 (x±s) 表示,应用SPSS 统计软件进行方差齐性检验、方差分析,P<0.05 为差异有统计学意义.

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  2、 结果

  2.1 胎鼠 NSC 的培养、鉴定

  原代细胞呈圆形球状,悬浮生长,2~3 d 后可见大小不等的细胞团,较大者由数十个细胞组成.细胞形态规则,边界清楚,折光性强 (图 1 A) .7 d 后可见由数百个细胞组成的细胞团,呈桑椹状.经添加 5%胎牛血清诱导 24 h 后,即可见到细胞团贴壁,各种不同形态的细胞从细胞团中长出,2~3 d 后可见大部分细胞贴壁生长,突起不断增粗和伸长,1 周后分化成大量形态不一的、分散成片的多突起星状细胞和神经元样细胞,突起互相交织成网状,表现出明显的神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的形态特征 (图 1 B) .2 周后部分神经细胞开始衰退、死亡.经含血清培养基培养 12 h、2 d、7 d、14 d 行Nestin 免疫荧光染色,12 h 和 2 d 时可见较多Nestin 阳性细胞,在荧光显微镜下呈现黄绿色荧光(图 1 C),在 7 d 时尚可见部分 Nestin 阳性细胞,2周时几乎未找到 Nestin 阳性细胞.A1254 对 NSC Nnat mRNA 表达的影响 (图2) .Nnat mRNA 的表达,0.10 ng/mL 组与对照组和溶剂对照组比较有所下降,差异无统计学意义(P>0.05);1.00 ng/mL 组和 10.00 ng/mL 组均较空白对照组和溶剂对照组下降,差异有显著性 (P<0.05) .提示随着 A1254 浓度升高,Nnat 基因表达下降 (表 1) .A1254 对 NSC Nnat 蛋 白 表 达 的 影 响 (图3) .Nnat 蛋白质的表达,0.10 ng/mL 组与对照组和溶剂对照组比较有下降,但无统计学差异 (P>0.05);而 1.00 ng/mL 组和 10.00 ng/mL 组均较空白对照组和溶剂对照组下降,差异有统计学意义(P<0.05) .提示随着 A1254 浓度升高,Nnat 基因表达下降 (表 1) .

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  2.2 A1254 对 NSC 细胞凋亡的影响

  A1254 染毒实验中,1.00 ng/mL 组和 10.00ng/mL 组中,NSC 细胞凋亡增加,与对照组和溶剂对照组比较差异有统计学意义 (P<0.05),提示随着 A1254 剂量的增加,NSC 凋亡逐渐增多 (表1) .

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  3、 讨论

  巢蛋白 Nestin 是胚胎中枢神经系统祖细胞的主要中间纤维蛋白,在大脑发育过程中高表达,在大脑发育成熟后表达量急剧下降,常常作为神经干细胞的特征性标志物.本实验中,神经干细胞培养液中所培养的原代细胞细胞 Nestin 表达阳性,免疫荧光染色后在荧光显微镜下呈黄绿色荧光.随着添加 5%胎牛血清诱导分化后表达量下降,甚至不表达.表现为含血清培养基培养 7 d 的Nestin 阳性细胞将少,培养 14 d 的 Nestin 阳性细胞消失.添加血清 24 h 后逐渐分化,出现神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的形态特征,该细胞具有多向分化的潜能.以上结果说明所培养的原代细胞为神经干细胞.目前环境污染已成为一个全球性问题,其中PCBs 是首批被 《斯德哥尔摩公约》 列入全球控制的 12 种持久性有机污染物之一,如今地球生物圈的任何地方包括地球两极和珠穆朗玛峰都有 PCBs的踪迹.我们日常的生活环境中,已经不可能完全隔绝 PCBs 污染的毒副作用.由于儿童处于组织器官生长发育的旺盛期,尤其是胎儿期,因此对环境毒物的毒性特别敏感,对成人无害的暴露剂量常常导致儿童严重的发育障碍.PCBs 可导致儿童体格、神经系统、内分泌系统、生殖系统等发育延迟.PCBs 具有高脂溶性,可通过胎盘和乳汁进入胎儿或婴儿体内.脑组织由于富含脂类而成为 PCBs 攻击的靶器官,研究表明极低浓度的PCBs (3 μg/kg 体重) 就能阻碍大脑发育的蛋白质合成.PCBs 的神经毒性机制可能包括:活性氧的产生、突触长时间增强效应的减低、细胞内信号传递和乙酰胆碱脂酶活性的改变等.PCBs 也可通过改变印记基因的表达状态,而抑制胎儿的生长发育.Nnat 基因作为一种高度保守的印记基因,与胎儿神经细胞的发育密切相关,可能作为大脑发育过程中离子通道的调节因子,并与神经系统的成熟或维持,以及空间位置和时间相关.A1254 是一种氯含量为 54%的常见 PCBs 混合物,分子量为 328.4.本研究发现,A1254 可下调Nnat mRNA 和蛋白质的表达,且随着作用剂量的增加,下调更加明显,同时出现 NSC 细胞凋亡的增加,推测 PCBs 可能通过改变 Nnat 基因的表达,从而导致了胎儿神经发育的损伤.PCBs 在全球原来被广泛用于电力设备、液压设备和热交换器等,具有难降解性、生物毒性、生物蓄积性和远距离迁移性的特点,在环境中存量大、隐匿、易扩散.大剂量 PCBs 急性中毒事件发生率远没有小剂量、隐形、慢性 PCBs 中毒常见,对胎儿的损害也更加难于预防和干预.目前儿童出现行为偏差、学习障碍的发病率增加,除外其他因素,是否与环境污染的恶化相关,尤其是妊娠期妇女其体内这类化合物的负荷增加是否有关,出生前 PCBs 暴露在一定程度上可影响婴儿的运动功能发育和学习能力受损.1979 年台湾发生了 PCBs 污染米糠油的问题,PCBs 暴露母亲所生育的 6 月~2.5 岁儿童,其 Bayley 婴儿发育量表显示婴儿精神运动指数 (MD)I 和心理运动指数(PD)I 都低于对照组儿童;6~7 岁儿童韦氏儿童智力量表比对照组低 5 分.行为异常和学习障碍的孩子常常没有明显的神经系统器质性异常,也缺乏相应的临床生化和影像学改变,其基因表达的异常,尤其是胎儿期表达的改变可能是导致了其神经行为偏差的原因之一.除了防止环境污染、避免接触以外,我们是否可以对已发生 PCBs暴露的母亲,逆转其基因表达的改变,例如上调Nnat 基因的表达,防止胎儿神经发育损伤的发生.由于 Nnat 基因的表达主要受甲基化的调节,而环境污染物可通过引起表观遗传修饰异常而产生毒副作用,因此,笔者下一阶段将计划研究A1254 对基因甲基化的影响,以及 Nnat 基因有无相应的改变.

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