病理学论文
免疫组织化学技术(免疫组化)是一种在临床病理诊断和生物医学研究中应用非常广泛的技术。
自 Coons 等成功应用免疫荧光方法以来，免疫组化经过不断改良，建立了多种简便、灵敏的方法。现今临床病理中主要应用亲和素 － 生物素(ABC)法进行诊断，但 ABC 法存在着背景深、灵敏度相对较弱等不足。本研究对 EnVision 法和 ABC 法进行比较，分析 2 种方法各自的优缺点，为临床病理检测提供更合适的方法。
1 资料与方法
1． 1 资料 选取 2012 年 1 月 － 2014 年 1 月确诊 10例肾母细胞瘤的肾组织标本和 7 例滤泡性恶性淋巴瘤的淋巴结组织标本。所有标本均来自于中山大学第一附属医院病理科。
1． 2 试剂 WT1 抗体( 批号:14012677C) 来自于福州迈新生物技术开发有限公司(中国);CD10 抗体(批号:D06828)、Bcl － 6 抗体(批号:1225504C)来自于罗氏公司(美国); ABC 试剂盒(批号:20001418)、EnVisionTMFLEX + Ｒb ( LINKEＲ ) 试剂 盒 ( 批号:20008198)和 DAB 显色试剂盒(批号:20008206)来自于 DAKO 公司(丹麦);其他试剂自配。
1． 3 方法 所有组织标本均为石蜡标本，每个石蜡标本连续切片，厚度 3 μm ～ 5 μm，分别制成 2 张玻片，将其分成 2 组(ABC 组和 EnVision 组)分别染色。
ABC 组经脱蜡、水化、修复等常规步骤后，用 WT1 抗体(1∶100)、CD10 抗体(1∶200)和 Bcl －6(1∶100)抗体孵育 1 h 后，直接用 HＲP － 复合物孵育 1 h，然后DAB 显色，苏木精染核，封片。EnVision 组在一抗孵育之前的步骤与 ABC 组相同，在 WT1 抗体、CD10 抗体或 Bcl － 6 抗体孵育后，用 EnVisionTMFLEX + Ｒb(LINKEＲ) 孵育 20 min，再用 HＲP － 复合物孵育40 min，然后 DAB 显色，苏木精染核，封片。所有染色后的玻片均通过 OLYMPUS 光学显微镜进行观察，应用相应的拍摄系统拍照后，进行数据分析。
2 结 果
2． 1 2 种方法染色过程的比较 EnVision 法染色的前处理与 ABC 法相同，应用二甲苯脱蜡，所用抗原修复液的种类、时间均一致，封闭剂都采用 3% H2O2。
EnVision 法染色所用一抗孵育时间为 30 min，较 ABC法缩短一半;二抗孵育中，EnVision 法需要前后经 En-VisionTMFLEX + Ｒb (LINKEＲ)和多聚体复合物 2 步，共需 60 min，而 ABC 法只需 1 步，时间也为 60 min。
DAB 显色、苏木精染核等步骤，2 种方法也均一致(表 1)。所以，EnVision 法比 ABC 法染色时间缩短30 min。【表1】
2． 2 WT1 在肾母细胞瘤中的表达 2 种方法检测出WT1 抗体表达差异较大。显微镜下观察，EnVision 组WT1 阳性表达的细胞呈深棕 色，染 色 背 景 清 晰(图 1A);ABC 组 WT1 阳/阴性表达的细胞着色对比度不大，细胞多呈浅蓝色，部分细胞呈深灰蓝色，背景较清晰(图 1B)。2． 3 CD10 在滤泡性恶性淋巴瘤中的表达 2 组染色均能够检测出 CD10 抗体表达，阳性细胞呈深棕色，阴性细胞不着色。EnVision 法染色的背景清晰，阴/阳性细胞着色对比度大，易于区分，不存在非特异着色(图 2A)，但 ABC 法染色的背景不清晰，整体呈弥漫着色，且有部分细胞非特异着色(图 2B)。2． 4 BCL － 6 在滤泡性恶性淋巴瘤中的表达 2 种染色均能够检测出 Bcl － 6 抗体表达，Bcl － 6 抗体阳性细胞呈深棕色，阴性不着色，但表达量区别较大。En-Vision 法检测 7 例滤泡性恶性淋巴瘤中 Bcl － 6 阳性表达细胞都在 80% 以上，而 ABC 组检测 7 例滤泡性恶性淋巴瘤中 Bcl － 6 阳性表达细胞均不超过 20%(图 3)。3 讨 论免疫组化方法是利用已知的抗体与抗原之间的特异性结合来鉴定组织和细胞内的某种物质的性质，利用过氧化物酶、碱性磷酸酶等作用于底物产生的颜色反应示踪的一种技术。免疫组化从最初的荧光素标记法到后来的酶标记法，经历了几十年的时间，已发展有 S － P 法、ABC 法、PAP 法及 EnVision 法等。
EnVision 法，又称多聚螯合物酶法，主要是在一个多聚体复合物上连接多个二抗和酶(HＲP 或 AP)，以增强检测的敏感度，由于此多聚体复合物的分子量大，穿透性较差，所以多应用在石蜡切片免疫组化染色中。有研究报道，此方法较 SP 法、LSAB 法等敏感度提高约 30 倍 ～ 40 倍。本研究主要是应用临床上最常用的石蜡标本为材料，以检测 EnVision法在常规病理中的应用价值，同时避免其受穿透性的影响。
不同抗体检测中 EnVision 法都能达到较理想的效果。相对 ABC 法，EnVision 法增加一个染色步骤，缩短了免疫组化的时间。EnVision法能够检测出肾母细胞瘤中 WT1 抗原的表达，阳性细胞呈深棕色，背景清晰;但 ABC 法未能够明确检测出 WT1 抗原的表达，染色后阴/阳性表达细胞对比度不强，仅有部分细胞呈深灰蓝色。EnVision 法与 ABC 法都能够检测出滤泡性恶性淋巴瘤中 CD10、Bcl － 6 抗原的表达。
ABC 法染色 CD10 表达区域呈弥漫性分布，有非特异性着色;EnVision 法检测 CD10 表达清晰，无非特异着色。EnVision 法检测 Bcl － 6 表达含量高达 80% 以上，而 ABC 法检测 Bcl － 6 表达含量仅在 20% 以下。
联合 CD10、Bcl －2 等多种抗体的免疫组化结果，确定EnVision 法检测的更为准确，ABC 法未能检测出大部分 Bcl －6 抗原的表达。
同时，还对比观察了 EnVision 法和 ABC 法检测Actin、CK、CD3 等 30 种常用抗体的效果。EnVision 法染色的背景无明显着色，敏感度高，非特异性着色少。
对于 CD31、α － SMA、Vimentin 等抗原表达强的抗体，ABC 法与 EnVision 法染色效果均较好;对于 Bcl － 6、CgA、WT1 等抗原表达弱的抗体，EnVision 法较 ABC法染色效果显着提高。
综上所述，本文认为，EnVision 法是一种敏感度高、特异性强、背景低、染色快速、操作简便的免疫组化方法，应该在临床病理检测中推广应用。