CD11b在脾脏和淋巴结的分布差异及其生物学特性

　　脾脏和淋巴结是成熟 T 细胞定居的场所，定居于此处的 T 细胞接受树突状细胞 (dendritic cell，DC) 、巨噬细胞提呈的抗原后活化、增殖，分化为效应性 T 细胞。脾脏在胚胎期具有造血功能，成年后成为最大的免疫器官，可清除血液中的病原体、衰老细胞及异物等。淋巴结是免疫应答发生的主要场所之一，淋巴结中 T 细胞的比例远高于脾脏。细胞在免疫器官的不同分布、功能与细胞表面的黏附分子密切相关。CD11b 是一种相对分子质量(Mr) 为165 000 ～ 170 000 的整合素 α 蛋白，常作为单核巨噬细胞的分化标志。CD11b 与 CD18 以非共价键结合形成补体 iC3b 受体(complement receptor of iC3b，CR3)。CR3 主要表达在巨噬细胞、NK 细胞、粒细胞、活化的淋巴细胞、B-1 细胞和小胶质细胞表面。CR3 可与细胞间黏附分子 1(intercellularadhesion molecule 1，ICAM-1 ) 结合，介导细胞间黏附，炎性细胞的趋化。为阐释 CD11b 在脾脏和淋巴结的分布差异及其生物学特性，本研究对 CD11b在 C57BL/6 小鼠脾脏和淋巴结细胞的表达及其功能进行初步探讨。

　　1 材料和方法

　　1． 1 材料 C57BL /6 小鼠，6 ～ 8 周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，小鼠饲养在河南省实验动物中心 SPF级环境。流式细胞术所用的荧光团标记的大鼠抗小鼠抗体(CD3-eFl660、CD4-FITC、CD8-PE、CD8-Percp-Cy5． 5、CD11b-PE、CD11b-eFl660、CD44-PE、CD62L-Percp-Cy5． 5 ) 及大鼠IgG2b κ 同型对照-PE 购自 eBioscience 公司。

　　1． 2 方法
　　
　　1． 2． 1 Freund 完全佐剂皮下免疫 小鼠分为 2 组，免疫组和对照组，每组小鼠5 只以上。Freund 完全佐剂(complete Freund'sadjuvant，CFA) 含灭活结核分枝杆菌 H37 Ra 5 mg / mL，与磷酸盐缓冲液以 1∶1 体积混合后彻底乳化，于 C57BL/6 小鼠背部两侧皮下注射乳化剂，总免疫剂量 200μL/只。

　　1． 2． 2 流式细胞术分析 取小鼠脾脏和淋巴结，制备单个核细胞悬液，计数 1 ×106细胞，按说明要求分别加入荧光团标记的抗体，4℃避光孵育 30 min; PBS 洗涤 2 次，流式细胞仪检测，分析 CD11b 在脾脏和淋巴结 CD3+和 CD3－细胞的表达; 分别以 CD3+CD4+和 CD3+CD8+细胞设门，分析 CD11b在不同 T 细胞亚群的表达; 先以 CD4+细胞设门，进一步以CD11b+和 CD11b－细胞设门，分析 CD44+CD62L+双阳性细胞在 CD11b+和 CD11b－细胞中的表达比例; CFA 免疫后，以CD3+CD4+细胞设门，分析 CD11b 在 CD4+T 细胞亚群的表达变化。流式数据用 Cellquest 软件分析。

　　1． 2． 3 统计学分析 所有数值以 x ± s 表示，两组间差异显着性用 t 检验进行分析，P ＜0． 05 表示差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2． 1 CD11b 在脾脏和淋巴结细胞中的差异表达CD11b 在脾脏细胞的总体表达(19． 9 ± 2． 5) % 略高于淋巴结(16． 0 ±4． 2)%，但 CD11b 在脾脏和淋巴结细胞的分布差异显着。在淋巴结，CD11b 主要表达在CD3+细胞(12． 52 ± 1． 32)%，CD3－CD11b+细胞仅占(2． 95 ± 0． 83)%。在脾脏，CD11b 主要表达于CD3－细胞(14． 93 ± 0． 94)% ，CD3+CD11 b+细胞仅占(4． 16 ±0． 77)%(图 1)。【1】

　　
　　2． 2 CD11b 在不同 T 细胞亚群的表达 CD11b 在脾脏和淋巴结 T 细胞中的表达分别为 (10． 49 ±1． 71) % 和( 11． 96 ± 1． 32 ) % ，差异无统计学意义(P = 0． 337)。但在脾脏和淋巴结 T 细胞中 CD11b 均主要表达在 CD4+T 细胞，而在 CD8+T 细胞上的表达较少。脾脏和淋巴结 CD4+T 细胞 CD11b 的表达分别 为 (18． 70 ± 1． 82)% 和 (20． 06 ± 1． 12)%(P =0． 185)，CD8+T 细胞 CD11b 的表达分别为(2． 29 ±0． 24)%和(2． 20 ±0． 20)%(P =0． 693)。【2】

　　
　　2． 3 T 细胞表达 CD11b 与其活化的关系 CD44 和CD62L 常用于评价 CD4+T 细胞的活化状态。CD4+CD11b+T 细 胞 中 CD44+CD62L+细 胞 占52． 4%，CD4+CD11b－T 细胞中 CD44+CD62L+细胞占10． 6%。提示，高表达 CD11b 的 CD4+T 细胞处于活化状态(图 3)。【3】

　　
　　2． 4 CFA 免疫诱导 T 细胞高表达 CD11b CFA 可刺激机体局部免疫反应，CFA 背部皮下免疫初始C57BL /6 小鼠，第 3 天获取集合淋巴结和脾脏细胞。

　　发现 CFA 免疫后淋巴结 CD4+T 细胞高表达 CD11b，由初始状态(淋巴结) 的(20． 06 ± 1． 12)% 升高至(58． 22 ± 3． 41)%(P ＜ 0． 01)。脾脏 CD4+T 细胞CD11b 表 达 轻 微 升 高， 由 初 始 状 态 ( 脾 脏 ) 的(18． 70 ±1． 82)%升高至(25． 42 ± 3． 17)%，但两者差异无统计学意义(P =0． 103，图 4)。【4】

　　
　　3 讨论

　　CD11b 是补体 iC3b 受体( CR3) 的 α 链。通常认为，CD11b 仅表达于巨噬细胞表面，在炎症反应中介导单核巨噬细胞对靶细胞的调理作用。目前，关于 CD11b 的研究多集中于中性粒细胞、单核巨噬细胞、髓系来源的抑制细胞和自然杀伤细胞。

　　CD11b 在 T 细胞上的表达研究较少，在小鼠 CD4+T细胞上的表达尚未见报道。Wagner 等报道，人外周血 T 细胞可少量表达 CD11b，CD11b 主要表达于CD8+T 细 胞， CD4+T 细 胞 活 化 后 也 可 表 达。

　　Ichikawa 等以 CD11c+细胞设门，发现小鼠脾脏细胞中存在一群 CD4+CD11b+细胞，并将其命名为CD4+DC。Koo 等在骨性关节炎和风湿性关节炎患者的关节滑膜液中发现大量 CD4+CD11b+细胞，并认为该群细胞为单核细胞。CD11b 在脾脏和淋巴结细胞的分布、在 T 细胞亚群的差异表达目前仍不清楚。本研究发现，CD11b 在脾脏主要表达于单核巨噬细胞，但在淋巴结主要表达于 T 细胞。脾脏大量存在的单核巨噬细胞与其清除衰老、凋亡细胞及异物有关。CD11b 可表达于脾脏和淋巴结 T 细胞，且主要表达于 CD4+T 细胞，CD8+T 细胞几乎不表达。CD11b 在小鼠 T 细胞亚群的表达与在人 T 细胞亚群的表达正好相反。如上所述，CD4+CD11b+细胞曾被作为 CD4+DC、单核细胞进行研究。本研究以 CD3+细胞设门，分析 CD11b 在 CD4+和 CD8+细胞中的表达，因此可以认为该群细胞为 T 细胞。

　　CD11b 在小鼠 CD4+T 细胞上的表达尚未见报道。

　　CD11b 是参与 炎症反应的重要黏附分子，CD11b / CD18 与其配体 ICAM-1 的相互作用对于中性粒细胞与血管内皮细胞的黏附，及其随后穿越血管内皮细胞发挥重要作用。相对于 CD4+CD11b－细胞，CD4+CD11b+细胞高表达 CD44 和 CD62L。

　　CD44 和 CD62L 是 T 细胞活化的标志分子。提示，CD4+CD11b+细胞为一群活化的 T 细胞。CD11b 可能作为黏附分子参与 T 细胞活化后的细胞迁移。

　　CFA 免疫后，集合淋巴结 CD4+T 细胞 CD11b 表达升高，脾脏 CD4+T 细胞 CD11b 表达轻微升高。本实验进一步印证 CD4+T 细胞 CD11b 的表达与细胞活化有关。Wagner 等报道，CD11b 仅在静止的人外周血 T 细胞表面少量表达，细胞活化后高表达 CD11b。

　　我们的研究结果与文献报道一致。

　　综上所述，CD11b 不仅表达于单核巨噬细胞，还可表达于 CD4+T 细胞，但几乎不表达于 CD8+T 细胞。CD11b 在 T 细胞亚群的差异表达与其功能有关。

　　CD4+CD11b+T 细胞为活化细胞，CD11b 为 CD4+T细胞的活化标志，可能作为黏附分子参与细胞活化后的迁移。研究生理和病理状态下 CD11b 的表达变化，调节 CD11b 的表达水平对某些疾病可能有潜在的治疗价值。