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EDTA抗原修复液高压法在免疫组化中的效果

来源:学术堂 作者:姚老师
发布于:2015-06-17 共2127字
摘要

  在免疫组织化学染色中,部分抗原的修复要通过EDTA抗原修复液煮沸法进行。笔者采用不同修复时间的高压法通过EDTA抗原修复液对抗原进行修复,并 与 煮 沸 法 的 修 复 效 果 进 行 对 比,旨 在 探 讨EDTA抗原修复液合适修复时间的高压法在免疫组化中的应用价值。

  1材料与方法
  
  1.1标本来源本组标本取自2013年6月至2014年4月贵州航天医院收治的肿瘤患者20例,其中肺癌11例、前列腺癌3例、胃间质瘤2例、淋巴瘤2例、间皮瘤1例、子宫内膜间质肉瘤1例、乳腺癌1例;标本均经10%中性福尔马林固定,常规脱水、石蜡包埋,切片厚为4μm,且均经病理证实为抗原表达阳性的肿瘤标本。

  1.2试剂和仪器
  
  (1)试剂:包括TTF-1、CK5/6、P504S、CD117、CD2、Bcl-6、CR、CD10、CD31、CEA共10种 常 用 抗 体;EDTA抗 原 修 复 液 (0.01M,pH9.0);PBS缓冲液(0.01M,PH7.4);即用型快捷免疫组化MaxvisionTM试剂盒。(2)仪器:包括烤箱、电热高压锅、培养箱等。

  1.3修复方法
  
  (1)高压法:取EDTA抗原修复液1500ml放入电热高压锅中加热至沸腾后,将放置在耐高温塑料架上的切片放入EDTA抗原修复液中,拧紧锅盖继续加热至喷气,扣上压力阀,分别于加热2、5、7min后打开排气阀,待EDTA抗原修复液冷却至室温取出切片备用。(2)煮沸法:取EDTA抗原修复液1500ml放入高压锅中加热至沸腾后,将切片放入EDTA抗原修复液中,盖上锅盖(锅盖不拧紧、亦不扣压力阀)继续加热20min,待EDTA抗原修复液冷却至室温取出切片备用。

  

  1.4免疫组化染色及结果判定
  
  免疫组化染色步骤参照试剂盒操作说明进行,用PBS代替一抗作为阴性对照,每种抗体均用即用型抗体浓度进行实验。由2位病理医师采用双盲法对标本染色结果进行评价,标本细胞呈深棕黄色者为强阳性(+++)、呈浅棕黄色为弱阳性 (+)、介于二者之间者为阳性(++),无着色者为阴性(-);阳性细胞≥50%为Ⅲ级、<5%为I级、介于二者之间为Ⅱ级。免疫组化染色结果以“染色强度/阳性细胞级别”的形式表示。

  2结果
  
  在EDTA抗原修复液高压法中,随着高压修复时间的增加,标本细胞染色强度和阳性细胞级别逐渐增加;当高压修复时间超过7min后,其染色效果与煮沸法相当。见表1.

  3讨论
  
  外检标本若采用10%中性福尔马林固定,常可导致组织中蛋白质分子内或分子间形成醛键,使部分蛋白抗原决定簇被隐藏起来,造成某些蛋白表达减弱或不表达、免疫组化染色效果欠佳。抗原修复正是针对这一现象进行的补救措施,其通过物理和(或)化学方法,不同程度地恢复抗原的原有空间结构,使被隐藏的抗原决定簇重新暴露出来,以达到理想的标记染色效果。抗原修复的方法较多,正确选择抗原修复方法是决定染色成败的主要因素之一[1].现已证实,高压法抗原修复因有封闭稳定的环境,能暴露出更多的抗原决定簇;但采用何种修复液还存在分歧,而且更多的实验人员主张采用碱性修复液[2,3].本实验应用高pH值(9.0)碱性EDTA修复液并通过高压法对抗原进行修复,实验结果显示,随着高压修复时间的增加,标本细胞着色程度逐渐增强、阳性细胞数逐渐增多,且到一定时间后能达到与煮沸法相当的修复效果,说明选择EDTA高压法对抗原进行修复是可行的、理想的,值得推广,其与王映梅等[4]研究的高压抗原修复直接法并应用EDTA抗原修复液对组织切片进行抗原修复的效果更好的结论相符合。

  在EDTA抗原修复高压法中,加热到2min时,多数抗体不着色或色淡;加热到5min时,修复效果逐渐明显;加热到7min时,染色效果几乎与加热20min的煮沸法一致。因此笔者认为,EDTA抗原修复高压法的加热时间选择为7min修复效果较好,可以代替煮沸法使用,并可减少一半以上的操作时间;若采用间接法修复,则还可以与柠檬酸抗原修复液在一个高压锅内同时进行,能够更节约操作时间。但由于高温高压和碱性溶液的作用,掉片几率会有所增加,故操作中除应保证薄切片和足够烤片时间外,彻底清洁处理玻片也很重要,若用经过系列处理的厂家专用免疫组化染色玻片效果更好。

  EDTA化 学 名 为 乙 二 胺 四 乙 酸,分 子 式 为C10H16N2O8,分子量292.24,易溶于碱性溶液,是一种螯合剂,可消 除福 尔马林固 定 产 生 的 不 利 因素[3],其在抗原修复中有肯定的作用,但详细的作用机制还需要深入研究。由于EDTA抗原修复液的pH值作用大于其所含有的化学成分,其在抗原修复中起至关重要的作用,因此,配制EDTA修复液时必须保证pH值准确在9.0,最好用电子pH计测定以确保准确性。

  pH过低或过高可用0.1M Na(OH)2或0.1M HCI调节,每次用后更换新溶液,以保证染色质量。

  总之,目前尚无一种抗原修复方法和修复液能适合各种抗体,故实践中需要不断探寻适宜抗原修复方法和修复液;但无论采用何种修复方法都应以准确的实验结果为最佳选择。抗原修复的研究还需要更多、更细致的实践经验积累。

  参考文献:
  [1]罗焕超,余琦,杨江辉,等.不同冷却方法对免疫组化检测结果的影响[J].标记免疫分析与临床,2009,16(4):259.
  [2]袁士成,张鋆歆,陈妹琼,等.探索细胞免疫组化染色抗原修复方法的合理选择[J].诊断病理学杂志,2011,18(6):472-473.
  [3]廖德贵,黄世章.不同的抗原修复方法对免疫组化染色结果的影响[J].临床医学工程,2009,16(3):62-63.
  [4]王映梅,李培峰,刘一雄,等.高压抗原修复方法在免疫组化染色的应用比较[J].细胞与分子免疫学杂志,2012,28(1):1098-1099.


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