EDTA抗原修复液高压法在免疫组化中的效果

　　在免疫组织化学染色中，部分抗原的修复要通过EDTA抗原修复液煮沸法进行。笔者采用不同修复时间的高压法通过EDTA抗原修复液对抗原进行修复，并 与 煮 沸 法 的 修 复 效 果 进 行 对 比，旨 在 探 讨EDTA抗原修复液合适修复时间的高压法在免疫组化中的应用价值。

　　1材料与方法
　　
　　1.1标本来源本组标本取自2013年6月至2014年4月贵州航天医院收治的肿瘤患者20例，其中肺癌11例、前列腺癌3例、胃间质瘤2例、淋巴瘤2例、间皮瘤1例、子宫内膜间质肉瘤1例、乳腺癌1例；标本均经10%中性福尔马林固定，常规脱水、石蜡包埋，切片厚为4μm,且均经病理证实为抗原表达阳性的肿瘤标本。

　　1.2试剂和仪器
　　
　　（1）试剂：包括TTF-1、CK5/6、P504S、CD117、CD2、Bcl-6、CR、CD10、CD31、CEA共10种 常 用 抗 体；EDTA抗 原 修 复 液 （0.01M,pH9.0）；PBS缓冲液（0.01M,PH7.4）；即用型快捷免疫组化MaxvisionTM试剂盒。（2）仪器：包括烤箱、电热高压锅、培养箱等。

　　1.3修复方法
　　
　　（1）高压法：取EDTA抗原修复液1500ml放入电热高压锅中加热至沸腾后，将放置在耐高温塑料架上的切片放入EDTA抗原修复液中，拧紧锅盖继续加热至喷气，扣上压力阀，分别于加热2、5、7min后打开排气阀，待EDTA抗原修复液冷却至室温取出切片备用。（2）煮沸法：取EDTA抗原修复液1500ml放入高压锅中加热至沸腾后，将切片放入EDTA抗原修复液中，盖上锅盖（锅盖不拧紧、亦不扣压力阀）继续加热20min,待EDTA抗原修复液冷却至室温取出切片备用。

　　1.4免疫组化染色及结果判定
　　
　　免疫组化染色步骤参照试剂盒操作说明进行，用PBS代替一抗作为阴性对照，每种抗体均用即用型抗体浓度进行实验。由2位病理医师采用双盲法对标本染色结果进行评价，标本细胞呈深棕黄色者为强阳性（+++）、呈浅棕黄色为弱阳性 （+）、介于二者之间者为阳性（++），无着色者为阴性（-）；阳性细胞≥50%为Ⅲ级、<5%为I级、介于二者之间为Ⅱ级。免疫组化染色结果以“染色强度/阳性细胞级别”的形式表示。

　　2结果
　　
　　在EDTA抗原修复液高压法中，随着高压修复时间的增加，标本细胞染色强度和阳性细胞级别逐渐增加；当高压修复时间超过7min后，其染色效果与煮沸法相当。见表1.

　　3讨论
　　
　　外检标本若采用10%中性福尔马林固定，常可导致组织中蛋白质分子内或分子间形成醛键，使部分蛋白抗原决定簇被隐藏起来，造成某些蛋白表达减弱或不表达、免疫组化染色效果欠佳。抗原修复正是针对这一现象进行的补救措施，其通过物理和（或）化学方法，不同程度地恢复抗原的原有空间结构，使被隐藏的抗原决定簇重新暴露出来，以达到理想的标记染色效果。抗原修复的方法较多，正确选择抗原修复方法是决定染色成败的主要因素之一[1].现已证实，高压法抗原修复因有封闭稳定的环境，能暴露出更多的抗原决定簇；但采用何种修复液还存在分歧，而且更多的实验人员主张采用碱性修复液[2,3].本实验应用高pH值（9.0）碱性EDTA修复液并通过高压法对抗原进行修复，实验结果显示，随着高压修复时间的增加，标本细胞着色程度逐渐增强、阳性细胞数逐渐增多，且到一定时间后能达到与煮沸法相当的修复效果，说明选择EDTA高压法对抗原进行修复是可行的、理想的，值得推广，其与王映梅等[4]研究的高压抗原修复直接法并应用EDTA抗原修复液对组织切片进行抗原修复的效果更好的结论相符合。

　　在EDTA抗原修复高压法中，加热到2min时，多数抗体不着色或色淡；加热到5min时，修复效果逐渐明显；加热到7min时，染色效果几乎与加热20min的煮沸法一致。因此笔者认为，EDTA抗原修复高压法的加热时间选择为7min修复效果较好，可以代替煮沸法使用，并可减少一半以上的操作时间；若采用间接法修复，则还可以与柠檬酸抗原修复液在一个高压锅内同时进行，能够更节约操作时间。但由于高温高压和碱性溶液的作用，掉片几率会有所增加，故操作中除应保证薄切片和足够烤片时间外，彻底清洁处理玻片也很重要，若用经过系列处理的厂家专用免疫组化染色玻片效果更好。

　　EDTA化 学 名 为 乙 二 胺 四 乙 酸，分 子 式 为C10H16N2O8,分子量292.24,易溶于碱性溶液，是一种螯合剂，可消 除福 尔马林固 定 产 生 的 不 利 因素[3],其在抗原修复中有肯定的作用，但详细的作用机制还需要深入研究。由于EDTA抗原修复液的pH值作用大于其所含有的化学成分，其在抗原修复中起至关重要的作用，因此，配制EDTA修复液时必须保证pH值准确在9.0,最好用电子pH计测定以确保准确性。

　　pH过低或过高可用0.1M Na（OH）2或0.1M HCI调节，每次用后更换新溶液，以保证染色质量。

　　总之，目前尚无一种抗原修复方法和修复液能适合各种抗体，故实践中需要不断探寻适宜抗原修复方法和修复液；但无论采用何种修复方法都应以准确的实验结果为最佳选择。抗原修复的研究还需要更多、更细致的实践经验积累。

　　参考文献：
　　[1]罗焕超，余琦，杨江辉，等.不同冷却方法对免疫组化检测结果的影响[J].标记免疫分析与临床，2009,16（4）:259.
　　[2]袁士成，张鋆歆，陈妹琼，等.探索细胞免疫组化染色抗原修复方法的合理选择[J].诊断病理学杂志，2011,18（6）:472-473.
　　[3]廖德贵，黄世章.不同的抗原修复方法对免疫组化染色结果的影响[J].临床医学工程，2009,16（3）:62-63.
　　[4]王映梅，李培峰，刘一雄，等.高压抗原修复方法在免疫组化染色的应用比较[J].细胞与分子免疫学杂志，2012,28（1）:1098-1099.