鼠疫实验动物高质量病理切片的制备方法

　　鼠疫作为自然疫源性烈性传染病，具有发病急、传染快、病死率高等特点[1].为了研究鼠疫菌常用小鼠、豚鼠和家兔等做为实验动物。鼠疫菌对实质脏器的侵害是鼠疫病理改变的特征[2-3],在接种了不同剂量的鼠疫强、弱毒鼠疫菌的实验动物，其体内的各个实质性脏器均有不同程度的病理变化，涉及到病原生物安全方面，其病理变化只能肉眼观察，很少将其病理组织做成病理切片进行镜下观察研究。这就需要在确保病原生物安全的前提下，将鼠疫的实验动物组织彻底消毒灭菌，同时防止组织块长期固定后固化浓缩，以备制作好鼠疫实验动物的高质量的病理切片。

　　1 方 法

　　1.1 鼠疫实验动物 从事鼠疫研究的实验动物主要是小白鼠、豚鼠及家兔等。在做鼠疫实验时要严格规范实验动物的接种的剂量、接种的部位、接种的步骤等。

　　1.2 鼠疫实验动物的取材、消毒及固定 鼠疫实验动物在处死后迅速取材，生理盐水冲洗干净后，固定，以保证原有的形态学结构。消毒固定最好选用中性甲醛溶液，相对 10 %的甲醛能较长的固定组织而不使组织固缩[4],固定标本的窗口以标本不变形为宜[5].

　　1.3 做鼠疫细菌再生长实验检查固定灭菌后的组织块[4]固定灭菌后将组织取出来用生理盐水冲洗干净，再用无菌棉试干组织表面的水分，用无菌的手术刀片切开组织的中央在平皿上压印做鼠疫细菌再生长实验及鼠疫噬菌体实验，看是否还有残留的鼠疫菌，待检查彻底无鼠疫菌时才可进行以下其他步骤。

　　1.4 组织洗涤、脱水、透明和浸蜡 组织在固定后要把渗入里面的甲醛固定液用蒸馏水洗去，否则留在组织中的固定液有的会妨碍染色，有的会产生沉淀或结晶。由于不同实验动物个体差异性大，故其脱水的时间要求不同。见表 1.

　　1.5 包埋 将熔化好的石蜡倒入包埋盒，用加温的镊子将浸蜡后的组织材料块切面朝下放入，待蜡液表层凝固即迅速冷却，完全凝固后即做成含有组织块的蜡块。

　　1.6 切片 包埋好的蜡块用刀片修整蜡块后，在切片机上切成一片接着一片的蜡带，用毛笔轻轻托起放在水浴槽展片。

　　1.7 展片、捞片和烤片展片：用眼科镊子镊起蜡带轻轻平铺在 40 ℃~45 ℃的水面上，借水的张力和水的温度，将略皱的蜡带自然展平。
　　
　　捞片：待切片在恒温水面上充分展平后，将蜡片捞到载玻片的中 1/3 和下 1/3 的中间，倾去载玻片上的余水。

　　烤片：先在 75 ℃烤片机上干烤 10~30 min 使得蜡片迅速融化，组织粘附于载玻片上，再在 65 ℃的温箱内烤片 0.5~1 h 左右，脱去溶化组织间隙的石蜡，及载玻片上多余的水分。

　　1.8 切片脱蜡及水化 干燥后的切片需脱蜡及水化才能在水溶性染液中进行染色。组织脱蜡透明等过程采用物质分子相似相溶原理，试剂有效成分容易减少，所以脱蜡试剂要及时更换[6].

　　1.9 染色 用常规 HE 染色染病理切图片标本。

　　1.10 切片脱水、透明和封片 染色后的切片尚不能在显微镜下观察，需经从低浓度到高浓度的酒精梯度脱水、二甲苯透明。取出切片，擦去多余二甲苯，滴一滴中性树胶，将盖玻片复盖于切片上。

　　2 小 结

　　石蜡病理切片制备过程包括取材、固定、洗涤和、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤，每个步骤都要掌握关键技术及操作细节，才能确保切片的质量。

　　鼠疫实验动物组织要在规定的时间段处死动物后迅速取材，生理盐水冲洗后固定，以保证原有的形态学结构。不能等鼠疫菌致死后再取材，一方面染疫后的实验动物组织在其死后易腐败变质，另一方面是鼠疫菌繁殖迅速，会累及多个脏器。要准确地按解剖部位病变部位取材，所取组织块的体积要合乎要求。保证鼠疫菌针对性的病理病变。

　　鼠疫的实验动物组织不同于其他组织材料，在固定消毒后，组织必须按严格要求规范的做鼠疫细菌再生长实验及鼠疫噬菌体实验，观察看是否还有残留的鼠疫菌，待检查彻底无鼠疫菌时才可进行其他步骤。同时由于不同实验动物的组织差异性，其脱水、透明、浸蜡的时间也不尽相同。

　　参考文献：
　　[1] 方喜业，王光明。鼠疫[J].生物学通报，2006,41（9）：1-4.
　　[2] 纪树立。鼠疫[M].北京：人民卫生出版社，1988,319.
　　[3] 卫生部地方病防治司。鼠疫防治手册[S].1991,115.
　　[4] 于守鸿，王丽，席亚芳，等。化学消毒剂对鼠疫实验动物灭菌效果观察[J].中国地方病学杂志，2007,26（5）：551-552.
　　[5] 印敏，徐有坤，李焕萍，等。病理切片制作全程质量控制的实践[J].中国实用医药，2011,6（6）：231-233.
　　[6] 马恒辉，周晓军。HE 染色常见问题对策[J].临床与实验病理学杂志，2008,24（4）：478-481.