流式细胞术诊断登革热患者T淋巴细胞免疫异常

　　登革热是由登革病毒引起，经伊蚊传播的一种急性传染病，潜伏期通常约5~7d,具有传播迅猛、发病率高等特点。登革热患者有可能出现极度疲倦及抑郁症状，少数患者会恶化至登革出血热，并进一步发生出血、休克，乃至死亡，登革热引起的并发症往往是患者致死的主因。一般来说登革热主要分布在热带及亚热带地区。每年世界上有1亿人受到登革病毒感染，近年来，随着旅游业的发展和全球温暖化，登革热疫情日益严重，已经成为一个世界性的严重公共卫生问题[1].郭汝宁等[2]报道2005~2010年广东每年都有发生登革热病例现象。

　　登革热发病机制至今尚未完全清楚，相关假说有：病毒亲嗜性、病毒毒力学说、宿主的易感因素、抗体依赖性增强感染作用（ADE）、交叉反应性T细胞反应及细胞因子风暴等假说。

　　登革病毒通过伊蚊叮咬进入人体，在单核-巨噬细胞系统和淋巴组织中复制至一定数量后，即进入血循环（第1次病毒血症），然后再定位于单核吞噬系统和淋巴组织之中[3].交叉反应性T细胞的激活假说是促进登革病毒感染临床进程的 关键，与DHF/DSS发生有关。

　　CD8+T细胞 可 以 在DENV感染早期控制病毒感染，但是，在清除感染细胞的同时CD8+T也参与了DENV感染的病理过程。病毒可以诱导出不同的交叉反应性T细胞反应，这些低亲和力非中和性的细胞无法有效地清除病毒。在初次感染登革病毒的小鼠中，只产生少量的登革特异性CD4+T细胞；然而，4个血清型的登革病毒二次感染后将导致CD4+T细胞的反应明显增加，不但提高了CD4+T细胞的INF-γ分泌水平，也增加了CD8+T细胞的活化[3-4].

　　本实验通过流式细胞术对登革热患者的T淋巴细胞进行检测，分析患者是否出现T细胞免疫异常。

　　1资料与方法。

　　1.1一般资料。

　　收集本院确诊登革热患者1 112例，平均年龄（48.5±10.88）岁，无相关自身免疫性疾病、肿瘤或近期感染史，50例健康者作为对照组。登革热患者的主要临床症状：发热、食欲下降、恶心、呕吐；皮疹持续3~4d,一般与发热同时消退；不同部位、不同程度的出血，如消化道出血，血尿及阴道出血等；淋巴结肿大。

　　1.2仪器与试剂。

　　仪器为BD CantoII,试剂为CD3、FITC/CD8、PE/CD45、PERCP/CD4、APC、溶血素、绝对计数管，均购自BD公司。

　　1.3方法。

　　抗体与外周血加入绝对计数管中孵育15min,加入500μL 1×溶血素，避光孵育10min,震荡混匀，上机检测。

　　1.4统计学处理。

　　使用SPSS13.0统计软件进行统计分析，若方 差 不 齐，则 组 间 比 较 采 用 秩 和 检 验。使 用GraphPadPrism5软件进行作图分析。

　　P<0.05为差异有统计学意义。

　　2结果。

　　流式细胞术检测出各细胞绝对计数值，与健康者进行比较，发现登革热患者的T淋巴细胞比例相对于健康者显着降低。CD3+CD4+、CD3+CD8+的淋巴细胞百分比分别为（36.54±9.78）%、（17.7±10.01）%,与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05）；CD3+CD4+的淋巴细胞数为（49.98±240.2）cells/nL,差 异 有 统 计 学 （P<0.05）、CD3+CD8+细 胞 数 为（380.9±364.6）cells/nL,差 异 有 统 计 学 意 义 （P<0.05），CD3+细胞数（874.8±541.2）cells/nL,差异有统计学意义（P<0.05），见表1、图1.1 112例登革热患者中，总体趋势相对健康者是降低，但是也有患者 在 正 常 范 围 之 内，也 有 患 者 是 呈 升 高 趋 势：其 中CD3+低于正常值的人数占64%,高于正常值的占2%;CD3+CD4+低于正常值的人数占60%,高于正常值的占1%;CD3+CD8+低于正常值的人数占50%,高于正常值的占7%,Th/Ts低于正常值的人数占6%,高于正常值的占16%.

　　3讨论。

　　对于登革病毒，目前并没有特异的疫苗与病原治疗药物，主要采取对症治疗措施，医生尽可能做到早发现、早隔离、早治疗[5-6].登革出血热，有休克、出血等严重症状，需积极处理。

　　休克者应及时补充血容量，可选用右旋糖酐40（低分子右旋糖酐）、平衡盐液、葡萄糖盐水等。目前很多种具有应用前景的登革热疫苗和抗病毒药物正在开发，进入临床试验阶段，但是仍存在许多亟待解决的问题[7].

　　登革热发病机制至今仍未完全阐明，其症状的严重程度受多种因素的影响。初次感染登革病毒，临床上表现为典型登革热，不发生出血和休克。再次感染异型登革病毒时，病毒在血液中与原有的抗体结合，形成免疫复合物，激活补体，引起组织免疫病理损伤，临床上呈现出血和休克。涉及参与的免疫反应包括体液免疫、细胞免疫、Fc受体介导的细胞凋亡等多个机制，彼此相互交错、促进和制约，推动疾病的进程[8].

　　宿主的易感性影响到宿主对登革病毒感染的免疫应答，而免疫应答产生的细胞因子和交叉反应性T细胞在清除病毒的同时又可以引起组织和细胞损伤，加之病毒血清型毒力不同，产生的二次感染诱导ADE,使病理过程更加严重。最近有研究同样表明，登革病毒感染后首要靶细胞是单核细胞，而不是T细胞或B细胞[3,9-10].

　　本研究中，流式细胞术检测出各细胞绝对计数值，与健康者进行比较，发现登革热患者的T淋巴细胞比例相对于健康者显着降低。

　　CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+与健康者相比显着降低。在1 112例登革热患者中，总体趋势相对健康者是降低，但是也有患者在正常范围之内，也有患者是呈升高趋势：

　　其中CD3+低于正常值的人数占64%,高于正常值的占2%;CD3+CD4+低于正常值的人数占60%,高于正常值的占1%;CD3+CD8+低于正常值的人数占50%,高于正常值的占7%,Th/Ts低于正常值的人数占6%,高于正常值的占16%.大多数研究机制都说明T细胞会降低[11],本研究中发现有一部分登革热患者T细胞升高，不管是升高还是降低，说明其免疫机制是紊乱的，具体的免疫机制需要进一步的研究。

　　参考文献

　　[1] 刘红，孙泉云。近几年暴发流行的三种蚊媒性病毒传染病[J].动物科学与动物医学，2002,19（8）：33-35.

　　[2] 郭汝宁，何剑峰，梁文佳。广东省2005-2010年登革热流行特征分析[J].实用医学杂志，2011,27（19）：3477-3480.

　　[3] 黄俊琪。登革热发病机制的研究进展[J].实用医学杂志，2011,27（19）：3464-3465.

　　[4]Beaumier CM,Rothman AL.Cross-reactive memory CD4+Tcells alter the CD8+T-cell response to heterologous secondarydengue virus infections in mice in a sequence-specific manner[J].Viral Immunol,2009,22（3）：215-219.

　　[5] 卫生部疾病预防控制局。登革热防治手册[M].2版。北京：人民卫生出版社，2008:74-84.