动物学论文
沙门菌是一种重要的人畜共患病原微生物，自Salmon和Smith于1885年分离出猪霍乱沙门菌以来，迄今为止，已经鉴定出2500多种血清型。由沙门菌引起的食物中毒在世界范围内几乎每年都有发生，它已经成为世界范围内最为重要的能引起人类食物中毒的食源性致病菌之一。对食源性沙门菌进行血清型和基因型研究，可以揭示沙门菌在不同地区、不同时间以及不同种类食品中的分布、流行病学特征以及菌株之间的同源性，为预警和控制食源性疾病暴发提供依据。自然界中，沙门菌通常存在于家禽、家畜等动物体内，而后通过动物粪便或者生产加工过程中的交叉污染感染人类。很多研究表明，养殖屠宰环节肉鸡制品存在较高的污染率，而污染了沙门菌的肉鸡制品又是导致人类发生食物中毒的重要原因。因此养殖屠宰环节的污染控制是全球控制肉鸡产品中沙门菌的重点。
为了解合肥市肉鸡沙门菌的携带情况，确保合肥市肉鸡养殖业抗生素的合理使用，同时为合肥市肉鸡沙门菌的防控以及食品卫生安全提供科学的基础数据，我们于2010年7－9月，在合肥市开展了肉鸡生产加工过程中沙门菌污染状况调查，分析了合肥市肉鸡沙门菌分离株的血清分型、耐药谱以及分子分型。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 菌株 12株沙门菌，分离自2010年7－9月，采集于合肥市10家肉鸡养殖场和14家肉鸡屠宰加工厂的45份肉鸡活体和45份肉鸡胴体标本。沙门菌药敏质控菌株大肠埃希菌ATCC25922、ATCC35218以及脉冲场凝胶电泳（PFGE）质控菌株H9812均为安徽省疾病预防控制中心（CDC）提供。
1.2 培养基与试剂 普通营养琼脂购自杭州微生物有限公司；科玛嘉沙门菌显色培养基购自美国科玛嘉公司；亚希酸盐亮绿磺胺（selenitebrilliantgreensulfa，SBG）增菌液、卡-巴二氏（CaryBlair，CB）运输培养基，均购自英国Oxoid公司；MH琼脂平板购自法国生物梅里埃公司；PCR所需10×缓冲液、TaqDNA聚合酶、dNTPs、引物等均购自大连宝生物有限公司；SeaKemGold琼脂糖购自美国Cambrex公司；蛋白酶K、限制性内切酶XbaⅠ、TaqDNA聚合酶，均购自大连宝生物工程有限公司。沙门菌诊断血清购自泰国S&A公司。
1.3 抗生素 氨苄西林（AMP）、阿莫西林-棒酸（AMC）、头孢曲松（CRO）、头孢西丁（FOX）、氯霉素（C）、四环素（TE）、阿米卡星（AK）、庆大霉素（CN）、萘啶酸（NA）、环丙沙星（CIP）、左氧氟沙星（LEV）、头孢吡肟（FEP）、头孢他啶（CAZ）、头孢噻肟（CTX）、复方新诺明（SXT），均购自英国Oxoid公司。
1.4 仪器 VITEK全自动微生物分析仪及鉴定卡片、BIORADPCR仪、GELDOCXR凝胶成像系统、CHEFmappe型脉冲场凝胶电泳仪。
1.5 检测方法
1.5.1 样品的采集和处理 采集养殖场屠宰前的活鸡肛拭以及屠宰加工过程中冷藏环节后、深加工之前的肉鸡胴体。肉鸡肛拭经SBG增菌后，接种科玛嘉沙门菌显色培养基进行分离培养；肉鸡胴体采用胴体漂洗法。
1.5.2 菌株的鉴定 根据GB4789.4－2010《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门菌检验》中的检测技术要求进行沙门菌的增菌、分离以及鉴定。同时对细菌生化鉴定阳性菌株进行PCR复核鉴定，引物invA和hilA，退火温度分别为52℃和58℃；产物片段大小分别为248和497bp。
1.5.3 血清分型 对分离的沙门菌，按照GB4789.4－2010《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门菌检验》以及泰国S&A公司提供的沙门菌血清诊断操作步骤进行，查阅沙门菌血清型抗原式对照表，根据测定得到的抗原式确定沙门菌的血清型。
1.5.4 药敏试验 药敏试验采用临床实验室标准化协会（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute，CLSI）推荐的标准琼脂纸片扩散法（KirbyBauer，KB），按照CLSI标准判读结果，分为敏感（susceptible，S）、中介（intermediatesusceptible，I）和耐药（resistant，R）3种。对于耐3种以上抗菌药物定义为多重耐药株。药敏测定中使用大肠埃希菌ATCC25922和ATCC35218作为标准质控菌株。
1.5.5 PFGE分子分型 采用美国CDCPulseNet推荐的统一分型方案进行PFGE分型。利用BioNumerics软件（AppliedMaths，Inc.）对PFGE图像进行处理和数据分析。PFGE分型所用标准菌株为全球参考菌株H9812。
1.6 统计学处理 利用SPSS17.0软件对肉鸡活体肛拭和肉鸡胴体中沙门菌的检出率进行检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肉鸡沙门菌分离鉴定采集的90份样品中，共检出沙门菌阳性菌株12份。其中45份肉鸡活体肛拭样品中未检出沙门菌；45份肉鸡胴体样本中，有12份样品检出沙门菌，检出率为26.7%。肉鸡胴体样品中沙门菌的检出率高于肉鸡活体肛拭样品，且差异有统计学意义（＝13.864，P＜0.001）。
2.2 PCR鉴定经PCR复核检测，所分离的12株沙门菌对invA和hilA基因的携带率均为100%。
2.3 血清学试验结果12株沙门菌共分为3种血清型，其中9株为印第安纳沙门菌，2株为鼠伤寒沙门菌，1株为肠炎沙门菌。
2.4 药敏试验结果12株沙门菌中有10株至少对1种抗生素耐药，其中对NA和AMP的耐药性最强，耐药株均为10株；对CAZ的敏感性最好，所有菌株全部敏感；有9株沙门菌对CN、C、LEV、CIP和TE耐药；8株对SXT耐药；7株对FEP、CTX和CRO耐药；3株对AMC耐药；2株对AK耐药；1株对FOX耐药。12株沙门菌中有10株对3种以上抗生素耐药，其中7株对10种以上的抗生素耐药，1株对13种抗生素耐药（表1和图1）。
2.5 PFGE分子分型试验用BioNumerics软件对12株沙门菌的PFGE图谱进行聚类分析，可将12株沙门菌分为7个PFGE基因型；2株鼠伤寒沙门菌带型一致，9株印第安纳沙门菌PFGE图谱差异较大，共分离出5种不同的PFGE带型，相似度为83.7%～100%，部分菌株相差2～3个条带。见图1.
本研究中PFGE结果显示，血清型相同的沙门菌，其PFGE谱型相似度也比较高，耐药谱相近的菌株PFGE谱型趋于一致。
3 讨论
3.1 肉鸡沙门菌污染情况分析。沙门菌是一种重要的人畜共患病原微生物，其所导致的食源性疾病几乎占所有明确病因的细菌性食源性疾病暴发事件的70%～80%。鸡是沙门菌的主要宿主之一，而鸡沙门菌主要来源于养殖屠宰环节的污染。本研究发现在这两个环节中，肉鸡沙门菌的污染率有明显差异，屠宰场的污染率明显高于养殖场，该结果与王燕梅等、李薇薇等的研究结果一致。可见，在各地肉鸡屠宰环节，沙门菌的污染都比较严重。提示在屠宰环节可能存在沙门菌交叉污染等问题，相关卫生部门应加强对宰杀和处理环节的消毒及卫生管理。而本研究中养殖场肉鸡沙门菌的零污染率，可能与养殖场大量使用抗菌药物有关，也可能与本研究中养殖场的选取及所采样本量不够大有关，因此确定合肥市肉鸡养殖环节沙门菌污染情况，还有待进一步调查。
3.2 肉鸡沙门菌血清型分布。自首次分离出猪霍乱沙门菌以来，迄今为止，已经鉴定出2500多种血清型，本研究中，合肥市肉鸡沙门菌最常见血清型为印第安纳沙门菌，其次为鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌，而2005－2006年欧盟监测的肉鸡优势血清型则为婴儿沙门菌和肠炎沙门菌，提示不同来源、不同地域，其肉鸡携带或污染的沙门菌血清型之间可能存在一定差异。合肥市肉鸡沙门菌血清型分布情况还需扩大样本量进行验证。
3.3 肉鸡沙门菌耐药谱分布。由于抗菌药物在畜牧业和临床的大量不规范使用，沙门菌的耐药率已大幅上升，多重耐药率也从20世纪90年代的20%～30%上升到70%。本研究中，12株沙门菌总耐药与多重耐药菌株均为10株，其中对NA和AMP耐药菌株数最高，均为10株，对CAZ不耐药，与李薇薇等以及杨保伟等的耐药结果一致。此结果提示NA和AMP已经不再适合合肥市肉鸡养殖过程的免疫。本研究中分离的沙门菌对头孢类药物的耐药性存在较大差异，说明合肥市肉鸡所携带的沙门菌很多都产生超广谱内酰胺酶，并且此酶不水解CAZ，而是水解CTXM型的内酰胺酶。合肥市肉鸡沙门菌存在如此严重的多重耐药现象以及复杂的耐药谱，提示该地区肉鸡养殖业抗生素使用复杂，生产加工环节中污染途径广泛，必须从食品生产的源头进行合理的干预，坚持合理适量用药，保证食品安全。
3.4 肉鸡PFGE分子分型在食源性疾病暴发研究中，食品中分离细菌的分型与溯源一直是核心问题所在，采用分辨力高，重复性好并且精确快速的分型技术进行沙门菌分离株的检测，对于了解沙门菌的污染来源，从根本上控制其传播等有着非常重要的意义。目前，PFGE分型技术以其较强的可重复性、较高的分辨能力以及结果的稳定可靠等优点，已被广泛用于菌株之间遗传多样性的分析、追溯菌株与疾病暴发的可能感染来源的同源关系，通过对分离菌株进行有效的溯源，最终达到控制和预警食源性疾病暴发的目的。本实验中，12株沙门菌共分离出7个PFGE基因型，相似性在60.3%～100%之间。9株印第安纳沙门菌共分离出5种不同的PFGE带型，相似度为83.7%～100%，且部分菌株条带差异基本为2～3条，Tenover等认为菌株间存在2～3条差异，可能是由酶切位点的缺失、点突变或者插入引起的，提示菌株之间高度相关性，由此可以认为本实验中的9株印第安纳沙门菌在亲缘关系上具有一定的相关性。同时，对比本实验中耐药性的测定结果发现，耐药谱相近的菌株PFGE谱型趋于一致。结果提示，合肥市肉鸡生产加工环节中分离出的沙门菌具有多样性，这些不同类型的沙门菌可能来自不同的污染途径，需要相关食品卫生监督管理部门加强对该地区零售鸡肉进行更为严格的卫生管理，确保食品安全。
参考文献
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