猪是人类能量代谢和肥胖的理想生物医学模型

　　目前，肥胖已经普遍地被认为是一种慢性疾病，它是由于脂肪细胞中脂质的大量积累储存所引起的，并且通常与脂肪组织的炎症和外周组织的胰岛素抵抗联系在一起。此外，肥胖是普遍Ⅱ型糖尿病发病的遗传诱因，并且在前驱糖尿病的条件下胰岛素敏感性会逐渐降低导致代谢或心血管代谢综合征。到目前为止，肥胖及其慢性炎症和胰岛素抵抗在发达国家是最普遍的疾病，对美国和全球都是沉重的健康和经济负担。在美国，每年花费在糖尿病上的钱估计在一千亿，并且大幅降低了人们的生活质量和缩短了其预期寿命。

　　最近的研究表明，从1960年到2004年成年人肥胖的比例从13%上升到了32%，现在，66%的成年人和16%的儿童处于肥胖或超重状态，并且预测到2015年，75%的成年人将面临超重或肥胖。因此引起了政府官员、研究者和普通大众广泛且高度的关注。这全都是因为目前的研究群体还很难对肥胖或具有肥胖倾向的个体提出长期的预防和干预策略。

　　虽然非常多的研究项目的目的在于探讨人类肥胖的分子基础及其并发症，但是对其根本的、整体的生物化学机制还没有被清楚地鉴定出来。现在，小鼠模型已经成为研究肥胖和代谢综合征的支柱，因为小鼠的饲养成本低，拥有完整的基因组信息和容易利用遗传工程对其进行修饰。尽管，除了 Zucker小鼠缺乏来普汀受体功能导致其极度贪食以外，其它小鼠模型均不能够可靠地产生至少3种以上的风险因子簇一致引起代谢综合征，同时其它始终展现出至少4种以上风险因子的动物模型还没有被鉴定。此外，人类和小鼠之间存在着代谢和生理学的差异，这些差异毫无疑问减缓了将生物化学的研究发现转移到预防或干预肥胖治疗和并发症过程的效率。如表 1 所示，研究者已经认识到了人类和小鼠在代谢和脂肪组织生物学上的显著差异，就是这些差异阻碍了研究者有效地将研究发现利用到人类的预防和干预技术和策略中，以此来缓和人类的危机。

　　所以，还需要去探究另外的互补模型，故猪就成为了人类能量代谢和肥胖的理想生物医学模型，因为猪像人类一样在出生后棕色脂肪就消失了。这可是非常重要的考虑，因为棕色脂肪具有调节能量平衡和能量体内平衡相关过程的能力。同时，猪也具有与人相似的代谢特征、心血管系统和适当的器官大小。另外，猪有足够厚的脂肪层对脂肪细胞或间充质细胞进行测定，不需要混合不同层或不同动物的脂肪组织。

　　1、猪肥胖模型的胰岛素抵抗和动脉粥样硬化

　　虽然一些代谢和心血管疾病由于强烈的对生长速率和瘦肉的选择发生于家猪身上，但是想直接诱导获得Ⅱ型糖尿病或对代谢综合征诊断标准的建立还是比较有限的。然而，当给现代的家猪喂养一定量的猪油和胆固醇时，家猪就会变成非常好的研究类人动物动脉粥样硬化的模型，并且研究者已经很成功地延伸了此模型，如链脲霉素诱导糖尿病加剧动脉粥样硬化。此外，给现代的猪喂养旧石器世代的食物与我们祖先狩猎采集的生活方式是一致的，与喂养谷类食物的全同胞相比全都比较精瘦、对胰岛素更敏感和更低的血液C反应蛋白浓度，这反映了现代的生活习惯。然而，Gottingen、Yucatan 和Ossabaw猪品种已经更广泛地用于肥胖和心血管疾病的调查中。其中，Ossabaw 猪品种是特别有价值的模型。值得注意的是，澳大利亚布里斯班抵御野生猪群的入侵是全球生物多样性的特殊贡献者，现在推测这些猪经历了对节俭表型的自然选择，为了在食物充足和贫乏的季节循环中存活下来，这持续发生在Ossabaw大陆从美国乔治亚海岸分离出来的500年间。

　　Ossabaw猪能够吃掉大量的食物，拥有比任何哺乳动物都高的总体脂水平，能在缺乏高脂食物的情况下形成病态的肥胖（图1）。如表 2 所示，更令人关注的是，给雌性Ossabaw猪饲喂高脂胆固醇食物能使其形成6种标准代谢综合征中的5种，包括早期胰岛素抵抗、显著的内脏脂肪扩张型肥胖、高甘油三酯血症和增加低密度脂蛋白（LDL）∶高密度脂蛋白（HDL）胆固醇、适度的高血压和冠状动脉疾病。

　　早期胰岛素抵抗在其他猪的模型中是很难得到的，并且因为所有早期胰岛素抵抗和冠状动脉疾病均发生在Ossabaw雌性猪身上，因此这个猪种可能会是非常特殊的模型，能够更大程度地去解释为什么代谢综合征和冠状动脉心脏疾病相关的死亡以如此高的速率发生于女性身上。基于这个新发现的模型，使对脂肪层之间的联系、脂肪因子生物学、构成代谢综合征的因子和糖尿病形成的认识成为现实。

　　低脂（限饲）饲喂与低脂肪组相同的食物，但是摄入受到限制以维持其成熟体重。3个组在6周龄时相互之间存在显著差异（P<0.01）。结果与节俭基因型驱动的过度进食一致，对猪饲喂高能量高脂肪食物不能减少摄入。

　　2、 TLR4在猪脂肪细胞中的功能性表达

　　慢性炎症是产生肥胖相关的胰岛素抵抗的重要贡献者，因此有必要利用生物医学模型来重塑慢性炎症。慢性炎症显著的状态包括增加脂肪表达肿瘤抑制因子α（TNF-α）和白细胞介素6（IL-6），并且增加血液的IL-6浓度。另外，免疫学的方法暗示脂肪细胞的快速扩张与肥胖相关。培养 3T3-L1 脂肪细胞的试验指出脂肪细胞能通过产生促炎症因子TNF-α和IL-6来表达Toll样受体（TLR）和细菌脂蛋白（LPS）。

　　Ajuwon等的研究将此发现扩展到了猪的脂肪细胞中，通过LPS刺激脂肪细胞来激活和核因子κB（NFκB）转录因子。在基础条件下 IL-6的表达比TNF-α要高，对LPS的刺激使细胞因子浓度积累的响应要比TNF-α更灵敏。另外，IL-6 在猪的正常血液中具有相当高的浓度，而TNF-α的水平则非常低。两者差异对人类调节 IL-6 的产生和信号是非常有用的，因此猪初级脂肪细胞可以认为是重要的、有效的研究肥胖和代谢综合征的模型。

　　3、猪脂肪组织的炎症

　　近来对小鼠模型的研究以及建立了TLR-4与炎症及肥胖的发生和发展的联系，至少饱和脂肪酸有一部分是通过激活TLR-4来调节促炎症效应，并且也通过小肠内毒素或食物脂肪激活TLR-4受体来诱导肥胖效应。迄今为止，还没有研究解决得了初级猪脂肪细胞或从培养的间充质血管细胞分离出的脂肪细胞中饱和脂肪酸对炎症的剧烈效应。同时还需要测定是否食物脂肪的摄入和脂肪酸谱的变化改变了猪脂肪细胞中循环内毒素的浓度，并且这些改变是否与人类发生的相似。

　　虽然如此，研究已经证明食物脂肪酸谱可以影响猪脂肪组织中的外源内毒素来下调TLR-4受体蛋白。因此，猪可以作为非常有价值的比较模型建立和比较脂肪酸对肥胖炎症通路的作用，对TLR-4等位基因的详细分析可能会给肥胖和代谢综合征提供非常有用的信息。现在有可靠的证据表明，肥胖会导致脂肪组织巨噬细胞的显著积累，巨噬细胞能够反应炎症状态的激活。化学增活素单核细胞趋化蛋白 1（MCP-1）、巨噬细胞迁移抑制因子和巨噬细胞炎症蛋白1α是脂肪组织免疫细胞浸润的贡献者。在肥胖的小鼠模型中，MCP-1在脂肪组织中的表达明显升高。

　　Xu等指出，在脂肪间充质血管细胞中并不仅仅是MCP-1的表达增加了，巨噬细胞炎症蛋白的表达也增加了。Chen等发现高脂饮食能诱导小鼠脂肪组织MCP-1和MCP-3的表达，并且在3T3-L1脂肪细胞中IL-6能明确地诱导MCP-1。这就有两个理由值得我们去关注，首先，IL-6在肥胖人类和Ossabaw猪的血液中是升高的；其次，IL-6的在脂肪组织中的根本性表达来自于脂肪细胞，而不是间充质血管细胞。

　　因此，如果高脂食物能引起脂肪细胞的炎症，使其产生IL-6，那么脂肪组织中巨噬细胞增加和激活直接决定因素就是食物中的脂肪。Weisberg等指出了趋化因子受体2（CCR2）在脂肪组织巨噬细胞的增加和炎症中的关键作用，它与MCP-1具有非常高的绑定亲和力。在这个重要的研究中，CCR2 的遗传缺陷组与肥胖对照相比会减缓肥胖的形成，并且还能减少脂肪组织巨噬细胞含量和炎症分子标记。

　　然而其他的研究获得了相反的结论。Neels等指出，儿童长期的高脂饮食和CCR2缺陷的遗传背景会是肥胖的潜在因素。这些矛盾就非常需要比较模型。但是，目前还没有任何研究报道是关于猪脂肪组织肥胖相关的巨噬细胞的浸润，也没有任何比较的数据。

　　4、猪的脂联素

　　脂肪细胞因子是脂肪组织分泌的调节性分子，除了上述提到的以外，脂联素似乎是与肥胖和猪炎症密切相关的。Fruebis等提出了充分的证据表明脂联素能够调节小鼠的脂质代谢和体重。其他的研究者也指出脂联素能刺激初级小鼠脂肪细胞葡萄糖的转运，通过胰岛素受体独立的酪氨酸磷酸化和激活IRS-1的机制。当胰岛素的浓度低于葡萄糖转运需要的最大值时，胰岛素刺激的葡萄糖摄取将增强。这些效应均依赖于AMP激活酶（AMPK）的激活和乙酰辅酶A羧化酶（ACC）的去活化作用。

　　研究指出，脂联素能抑制猪初级脂肪细胞的葡萄糖碳掺入到脂质中，这与脂联素的AMPK激活ACC的去活化作用的结果是一致的。早期对脂联素的研究指出，与肥胖和胰岛素抵抗相关的循环浓度降低了。从那以后，其他研究者在不同的人种群体中证实了这些结论，并且证明低脂联素血症与血脂障碍之间存在明确的关系。

　　研究也指出，猪与人类一样脂联素和来普汀相互调节着肥胖，而且肥胖猪的血浆来普汀和脂肪mRNA表达增加了，肥胖的基因型中脂联素相对较低。这是一个重要的发现，因为在fa/fa小鼠模型中，棕色脂肪组织脂联素的表达增加了，看起来像是在某些环境下否定了白色脂肪组织脂联素的减少。因此，肥胖型与瘦型小鼠相比，循环脂联素浓度会根本性的增加。同时，也有大量文献指出，肥胖者的低脂联素血症主要是由于内脏脂肪细胞与皮下脂肪细胞相比，前者具有更低的脂联素表达，至少在日本人和Zucker肥胖型小鼠身上是这样的。这个概念在人类身上也得到了强调，人网膜脂肪细胞在体外产生更多的脂联素，与皮下脂肪细胞相比，对胰岛素、罗格列酮或胰岛素与罗格列酮的结合会有更强烈的反应。空腹血浆胰岛素浓度与血浆脂联素浓度呈现负相关关系，对3T3-L1脂肪细胞作持续的胰岛素处理能使脂联素mRNA表达水平降低。然而，其他的研究指出，在人类内脏脂肪细胞和小鼠棕色脂肪细胞中胰岛素能提高脂联素mRNA的表达水平，并且非常有可能存在物种和脂肪组织层之间不同的脂联素调节。这些可能性都必须以猪作为模型来进行试验验证。

　　由于脂联素大部分是由脂肪细胞产生的，因此这种脂肪因子的抗炎症活性对肥胖者常见的脂肪组织长期炎症状态是特别重要的。Yokota等首次报道了脂联素能够抑制活化的人类巨噬细胞产生促炎症细胞因子。从这以后，其他的研究也发现 TNF和IL-6在猪活化的巨噬细胞和THP-1单核细胞具有相似的功能。同样，当对猪的脂肪细胞进行 LPS诱导炎症时，在脂联素的作用下NFκB的激活被中断，并且IL-6的表达和释放也减弱了。

　　促炎症细胞因子强烈地与胰岛素抵抗的形成和脂联素表达的协调相关。所有的 TNF 和 IL-6 在3T3-L1或人类脂肪细胞中均能抑制脂联素mRNA表达或蛋白质合成。Sopasakis 等研究发现细胞间液与血浆相比具有更高的IL-6浓度，并且脂肪细胞暴露在一定浓度的IL-6下比细胞间液具有较低的脂联素mRNA丰度。

　　因此，诱导炎症反应需要抑制脂联素，并且因为这种激素的抗炎症活性，那么炎症反应在脂联素降低时会被放大。这个循环或许就是肥胖相关的炎症的中枢过程，故需要在猪肥胖模型中去了解脂肪层脂联素状态、肥胖和炎症之间的关系。脂联素调节AMPK可能是决定能量代谢和储存的关键，因此，AMPK在肥胖及其并发症方面受到了密切的关注。在大多数真核生物中，AMPK复合物是一个相当保守的丝氨酸/苏氨酸激酶异源二聚体，由α-、β-和γ- 3个亚单位组成。这些亚单位起着燃料的作用，当任何细胞三磷酸腺苷（ATP）耗尽时会发生交互作用使一磷酸腺苷（AMP）上升。这种酶不仅仅能通过glut-4来促进葡萄糖的摄入，还能促进脂肪酸的氧化。

　　有趣的是，在1980年中期，在发现猪RN基因的时候鉴定和定性出了AMPK γ3的变异。这在汉普夏猪中比较普遍。这个变异导致的主要表型变异是显著增加了骨骼肌糖原的含量，最终导致肉的极限pH和含水量较低。

　　但是，肝脏和心脏的糖原含量并没有发生改变。造成这种 RN 猪的表型是蛋白激酶AMP激活的γ3基因（PPKAG3）单错义突变引起的，这个基因能编码AMPK同工型γ3。另外，猪肌肉的第2个变异（V224I）也被鉴定了出来，发生在PPKAG3位置的第3个功能等位基因，是由Val199→Ile的单错义突变引起的。这个变异与 RN 等位基因相比具有相反的效应，即低糖原含量和高pH。因此，R225Q与V224I相比，它是一个功能缺失的变异，能终止AMP/ATP的异构调节，进而引起AMPK活性的增加。

　　虽然没有直接证据表明猪R225Q的变异可能会通过增加脂质氧化来阻止胰岛素抵抗和Ⅱ型糖尿病的发生。Shen 等假设在肥胖型Ossabaw猪身上降低AMPK活性与V224I的错义突变相关，进而改变骨骼肌AMPK活性和引起哺乳动物雷帕霉素靶向基因（mTOR）活性的升高。这些研究者同样推测mTOR-p70S6k信号对IRS-1的负反馈会引起肥胖猪的胰岛素形成，但是这个假设还没有得以证实。猪模型的 AMPK 和脂联素还意味着肝脏脂质代谢。给 Yucatan 猪饲喂缺乏叶酸的食物和40%的乙醇，结果表明，肝脂质合成增加了，同时AMPK活化驱动的脂联素介导的通路下调了。如先前提到的，脂联素能通过激活AMPK刺激葡萄糖的利用和脂肪酸的氧化，但是我们对这些通路的理解仅仅发生在猪肥胖模型的幼儿阶段，目前对这些关系是否能准确的反应人类生物学过程还不清楚。

　　肥胖是公众面临的主要健康危机，在小鼠模型上已经发现了许多重要和有意义的结论，未来能够明确的事情就是需要另外的补充模型来加快将科学转化成可控的预防和干预技术。猪，尤其是Ossabaw雌性猪，可能会在肥胖及其并发症分子机制的研究上起着关键的作用，因为此种相对生命周期较短的动物身上能形成所有代谢综合征的标准症状。

　　同时，猪基因组测序的完成也能提升猪作为分子反应物的可用性，这些均能为研究者提供更强有力的平台以寻求新策略来减缓这个巨大的健康危害。