吡咯喹啉醌对水生甲壳类动物的生理作用

　　吡咯喹啉醌( Pyrroloquinoline quinone，简称 PQQ) ，是烟酰胺核苷酸( NAD+和 NADP+) 和黄素核苷酸( FAD 和 FMN) 之外的第 3 种有机辅基。自 20 世纪 70年代末其化学结构被确认以来，PQQ 的相关研究已经开展了近 35 年。研究发现，PQQ 既是一种植物生长促进因子，也是哺乳动物生长、发育和繁殖的重要营养物质。这种由某些细菌产生的小分子醌化合物，以皮摩尔或纳摩尔水平，存在于各种植物、动物甚至人体组织内。目前认为，动物和人体肠道菌群不能合成 PQQ 或合成量远远不能满足机体需要，其体内的 PQQ 主要是通过外源性饮食途径获得。日本学者曾建议将其列为一种新的 B 族维生素，但这一提法学术界尚存在争论。迄今为止，PQQ 生理功能的研究已经在国内外广泛开展，但其对水生生物是否能够发挥生理作用，亦或者水生生物能否对 PQQ 产生生理响应，尚不清楚。本文以国际公认的标准试验生物大型溞( Daphnia magna) 为受试对象，通过外源性添加PQQ，分析其对溞类个体繁殖、寿命和抗饥饿能力的影响，旨在揭示 PQQ 对水生甲壳类动物的生理作用，为其将来在水生生物学领域的应用奠定基础。

　　1、 材料与方法

　　1. 1 材料

　　PQQ( 纯度≥98% ) 购于上海医学生命科学研究中心有限公司，使用时用超纯水配制成 3 mmol/L 的储备液，用一次性无菌注射器和 0. 22 μm 孔径的滤膜过滤后，4℃冰箱贮存备用。试验用溞由辽宁省水生生物学重点实验室提供，实验室内用灭菌的自来水培养，以单细胞微藻斜生栅藻( Scenedesmus obliquus) 为食物，连续孤雌生殖繁殖同步幼溞。

　　1. 2 方法

　　1. 2. 1 繁殖、发育与存活试验

　　收集24 h 以内出生的同步幼溞，随机分配于12 孔细胞培养板内，每孔 1 只，孔内含有 3 mL 无菌水，以浓缩的微藻作为食物，投喂密度为 4 × 105个细胞/mL，投喂频率为每天 1 次，25℃ ±1 ℃恒温培养。试验设立 3个 PQQ 处理组，浓度分别为 5、15 和 25 μmol/L，对照组不加 PQQ，每组 6 个平行。每天观察记录溞脱壳和产卵情况，当溞开始繁殖后，及时移出新产的幼溞并记录数量。每2 d 更换1 次试验用液，连续试验直至所有溞体全部自然死亡。

　　1. 2. 2 饥饿试验

　　收集肠道食物已经排空的 3 龄同步溞，随机分配于 100 mL 烧杯中内，每个烧杯 10 只，杯内含有 30 mL无菌水，不投喂任何食物，20℃ ± 1℃ 恒温培养。试验设立3 个 PQQ 处理组，浓度分别为0. 1、0. 5 和1 mmol/L，对照组不加 PQQ，每组 3 个平行。每天观察记录各组溞个体死亡数量，并移出死亡个体。每天补充蒸发的水分保持液面体积恒定，连续试验直至所有溞体全部死亡。

　　1. 3 统计分析

　　应用 SPSS 15. 0 对数据进行单因素方差分析，LSD法分析组间显著性差异，P 值小于 0. 05 视为差异显著。

　　2 、结果

　　2. 1 PQQ 对大型溞繁殖的影响

　　与对照组相比，不同浓度的 PQQ 对大型溞的首次怀卵时间、首次产卵时间与首次产幼量均无显著影响( P ＞0. 05) ，PQQ 各处理组之间亦无显著差异( 表 1) 。

　　由表 2 可知，5 μmol/L 的 PQQ 能够显著提高总产幼量( P ＜ 0. 05) ，15 μmol/L 的 PQQ 则显著提高了平均每窝产幼量( P ＜ 0. 05) 。组间差异性分析表明，15μmol /L PQQ 处理组的总窝数显著低于 5 μmol /L PQQ处理组( P ＜0. 05) ，25 μmol/L PQQ 处理组的总窝数和总产幼量均显著低于 5 μmol/L PQQ 处理组 ( P ＜0. 05) 。

　　2. 2 PQQ 对大型溞发育与存活的影响

　　由表 3 可知，不同浓度的 PQQ 对大型溞发育过程中的幼龄数、成龄数、总龄数以及存活时间均无显著影响( P ＞0. 05) 。组间差异性分析表明，15 和 25 μmol/LPQQ 处理组的成龄数、总龄数和存活时间均显著低于5 μmol / L PQQ 处理组( P ＜ 0. 05) ，而 3 组间的幼龄数则无显著变化( P ＞0. 05) 。

　　2. 3 PQQ 对大型溞抗饥饿能力的影响

　　由表 4 可知，饥饿条件下，不同浓度的 PQQ 对大型溞的初始死亡时间无显著影响( P ＞ 0. 05) ，但日均死亡数均显著降低( P ＜ 0. 05) ，而 0. 1 和 0. 5 mmol/LPQQ 处理组的最长存活时间和半数死亡时间 LT50均显著高于对照组( P ＜ 0. 05) 。组间差异性分析表明，0. 1和 1. 0 mmol/L PQQ 处理组的最长存活时间显著低于0. 5 mmol / L PQQ 处理组( P ＜ 0. 05) ，两者的日均死亡数则显著高于 0. 5 mmol/L PQQ 处理组( P ＜ 0. 05) 。3组间的 LT50值均有显著差异( P ＜0. 05) 。

　　由图 1 的存活曲线可以看出，对照组溞在饥饿后第 2 天大量死亡，仅有 2 只个体存活，而 0. 1 和 0. 5mmol / L PQQ 处理组溞的存活个体数分别为 8. 33 只和9 只。饥饿后第 3 天对照组溞全部死亡，而 3 个 PQQ处理组的溞个体仍有存活，其中以 0. 5 mmol/L PQQ 处理组的存活数达到了 5. 33 只。随着时间的延长，0. 5mmol / L PQQ 处理组溞的存活数缓慢下降，显示出了较好的抗饥饿效应。

　　3、 讨论

　　3. 1 PQQ 对大型溞繁殖、发育与存活的影响

　　研究表明，饮食中缺乏 PQQ 会导致试验小鼠和大鼠出现一系列的不良反应，包括新生幼鼠生长发育受损，免疫功能缺陷和母鼠繁殖能力下降等。近年报道显示，饮食中添加 PQQ 能够促进母鸡产蛋率和提高蛋质量，同时增强母鸡的抗氧化应激能力。本研究表明，PQQ 能够增强大型溞的繁殖能力，以 5 μmol/L 浓度效果最好，表现为总产幼量显著增加。这与哺乳动物和禽类的研究结果相类似。PQQ 对大型溞的首次怀卵时间、首次产卵时间与首次产幼量均无显著影响，这说明其促繁殖作用主要发挥于繁殖中后期。以前的研究证明，PQQ 既是一种强抗氧化剂，也是一种强促氧化剂，因此被认为是“双面”分子。PQQ 的最终效应取决于其作用浓度和所处的微环境。本研究显示，PQQ 浓度增加到 15 和 25 μmol/L 会导致其促繁殖效应的下降，主要反映在总产幼量和总窝数的减少，因此推测 PQQ 浓度过高可能会对动物的繁育起到负面作用。PQQ 对大型溞的龄数和存活时间无显著影响，但值得注意的是，与 5 μmol/L 浓度组相比，15 和25 μmol / L 的 PQQ 显著降低了大型的龄数和存活时间，这种浓度依赖效应与繁殖试验所得到的结果类似，提示高浓度的 PQQ 很可能还会显著影响动物的发育过程，降低动物的存活时间( 寿命) 。

　　3. 2 PQQ 对大型溞抗饥饿能力的影响

　　由于自然界中环境的变迁、季节更替以及食物在时空上的不均匀分布性，动物在其生命周期中经常面临食物资源的短缺而受到饥饿胁迫。甲壳类是水生动物中的一个主要类群，其饥饿生理的研究由来已久。线粒体是细胞的能量工厂，同时也是内源性氧自由基产生的主要细胞器。全饥饿条件下，机体的外界能源物质供给中断，线粒体内的能量代谢方式发生转变，氧自由基过度产生，机体内环境平衡被打破，这是导致动物机体死亡的主因。本研究表明，PQQ 能够保护大型溞免受饥饿胁迫损伤，表现为饥饿溞体的存活时间明显延长，LT50值升高以及日平均死亡个体数的降低。其中，以0. 5 mmol/L 浓度的 PQQ 作用效果最为明显。PQQ 与线粒体之间的关系已经有过很多研究，并已成为 PQQ 生物学功能机理研究的热点之一。

　　PQQ 能够保护线粒体免受氧化损伤，调节线粒体的质量和功能，逆转线粒体复合体Ⅰ抑制剂二亚苯基碘DPI 的抑制作用等等。线粒体的生物发生是由过氧化物酶体增殖活化受体 γ 共激活因子 － 1α( PGC-1α) 和核呼吸因子( NＲF) 等转录因子共同调节。PQQ能够激活 PGC-1α 启动子，增加其 mＲNA 和蛋白表达，并增强 PGC-1α 通 路 中 NＲF1、NＲF2、Tfam、TFB1M、TFB2M 等其他转录因子 mＲNA 的表达，从而增加线粒体发生和氧化代谢水平。因此，我们推测 PQQ 的抗饥饿应激效应与其调节线粒体功能密切相关。