利用RAPD分子标记技术研究3个品系兔群体遗传多样性

　　大耳白黑眼兔特征为全身纯白色的毛被、黑眼，又称为白毛黑眼兔( white hair black eyes rabbit，简称 WHBE 兔) ，该兔是本研究组在实验用日本大耳白兔( JW 兔) 生产群中发现了一只雄性 WHBE 兔后，通过回交—近交方式( 包括同胞和半同胞之间的交配) 进行保存的一个新实验兔封闭群，已连续封闭繁殖 7 代，生产种群达 400 多对，经鉴定命名为日本大耳兔黑眼系，现主要用于抗体的制备。本研究组对 WHBE 兔血液学研究发现，WHBE 兔的网织红细胞、白细胞显著低于 JW 兔，而淋巴细胞和血红蛋白含量均显著高于 JW 兔; 遗传学分析发现WHBE 兔群体的基因纯合度高于 JW 兔，具有更优的遗传稳定性。在 WHBE 兔与 JW 兔遗传育种中，发现第一代中未出现 WHBE 兔，在进行回交或第二代中均出现了 WHBE 兔，WHBE 兔自交后代未出现分化，这在毛色基因遗传学研究中是一种新发现，由于 WHBE 兔遗传性状稳定，表型易于鉴别，遗传容易控制，为实验动物遗传质量标准化研究的极为理想的实验动物。

　　RAPD 技术自创立以来，由于其灵敏、方便、多态性高等优点，被广泛用于多种动植物的系统进化、种质鉴定、群体遗传变异分析、目标性状基因的分子标记以及遗传图谱的快速构建等领域。本文利用 RAPD 分子标记技术对 3 个品系兔群体遗传多样性进行研究，检测实验兔不同品系之间以及同一品系不同个体之间的亲缘关系及其遗传多样性。
　　
　　1 材料与方法

　　1． 1 材料

　　1． 1． 1 样品采集

　　WHBE 兔 30 只，JW 兔 30 只，NZW 兔 30 只，雌雄各半，由浙江中医药大学实验兔生产基地［SCXK( 浙) 2009-0042］提供。采集耳廓皮肤样品，－ 20℃保存。

　　1． 1． 2 主要仪器和试剂

　　S1000 PCR 扩增仪( Bio-Rad) ; EPS 601 水平电泳仪 ( GE) ; Bioimaging Systems 凝 胶 成 像 系 统( UVP) ; 台式冷冻离心机( Thermo) ; UHQ 无离子纯水仪( Millipore) ，Varioskan flash 多功能酶标仪 (Thermo) 。

　　PCR 引物由上海生工生物工程公司合成，PCR反应试剂包括 dNTP mixture，Taq DNA 聚合酶( 5 U/μL) ，10 × PCR buffer，Mgcl2( 25 mmol/L) ，DL2000DNA marker 购自宝生物工程( 大连) 有限公司。

　　1． 2 方法

　　1． 2． 1 样品基因组 DNA 的提取

　　分别取 90 只兔的耳廓皮肤组织 100 mg 剪碎，加入 500 μL 消化缓冲液，混匀后加入终浓度为 100μg/mL 的蛋白酶 K，55℃ 消化过夜。经苯酚∶ 氯仿∶异戊醇( 25∶ 24∶ 1) 抽提，无水乙醇沉淀基因组 DNA，70% 无水乙醇洗涤一遍，烘干，加入 200 μL TE 缓冲液溶解的 DNA，经多功能酶标仪检测 DNA 纯度和DNA 含量，将 DNA 浓度稀释至 50 μg / mL，－ 20℃ 冻存备用。

　　1． 2． 2 RAPD-PCR

　　根据文献，选择了 60 个 RAPD-PCR 引物用于本实验。20 μL PCR 反应体系: 1 × PCR buffer，2． 5 mmol / LMgCl2，0．25 mmol/L dNTP，20 pmol 随机引物，1． 25 UTaq 酶，300 ng DNA 模板，加 ddH2O 至 20 μL。PCR 程序: 预变性 94℃ 7 min，然后 94℃ 1 min，36℃ 退火 1 min，72℃ 延伸 2 min，共 40 个循环，72℃延伸 10mins，4℃保存。

　　1． 2． 3 PCR 产物的琼脂糖水平电泳鉴定

　　( 1) 电泳缓冲液的制备: 配制 50 × TAE 缓冲液，取 60 mL 加蒸馏水至 3000 mL，配置成 1． 0 ×TAE 稀释缓冲液，待用。

　　( 2) 水平电泳胶制备: 称取 0． 45 g 琼脂糖，置于锥形瓶中，加入 30 mL 1． 0 × TAE 缓冲液，放入微波炉加热至琼脂糖全部熔化，取出，加入 2. 5 μLGelred 染液，摇匀。

　　( 3) 胶板制备: 将胶槽置于水平面上，插上梳子，小心倒入已制备好的电泳胶，形成均匀的胶层。待胶完全凝固后拔出梳子，然后向槽内加入 1． 0 ×TAE 缓冲液至液面没过胶板上表面。

　　( 4) 加样电泳: 取 PCR 产物 5 μL，加入 1 μL 6× loading buffer，并用移液枪小心将样品点入电泳槽内，最后在第一孔加入2． 5 μL DL2000 DNA mark-er。合上电泳槽盖，接通电源，电压在 60 V，电流 40mA，时间 90 min。

　　( 5) 拍照观察: 凝胶用 UVP 凝胶成像系统拍照，保存。

　　1． 2． 4 数据统计和处理

　　记录下电泳后凝胶上清晰可见的扩增条带，每一个体的扩增条带以”1”或”0”记录，出现扩增条带的记为”1”，相应位点无扩增条带的记为”0”，将此结果输入 Popgene 3． 2 软件中，统计相应结果:

　　( 1) 多态位点比: 在某一特定位点上，若扩增片段出现的频率小于 0． 99，则此位点称为多态位点。多态位点比率 P = ( 多态位点数/检测到的位点总数) × 100
　　
　　( 2) 遗传相似系数和遗传距离: 按 Nei的方法计算群体间的遗传相似系数 S: S = 2Nij/( Ni +Nj) ，其中 Nij 为两群体共有的位点数，Ni 和 Nj 分别表示两群体各自的位点数。遗传距离: D = 1 － S。

　　( 3) Shannon 多样性指数: Shannon 多样性指数是生态学中用于度量物种多样性的最常用方法，Chalmers 将其改进后用于量化分析 RAPD 数据的遗传多样性。其计算公式:H = － Σ PilnPi / N，其中 H 为多样性指数; Pi 为表型频率，即第 i个位点在群体中出现的频率，N 为检测到的总位点数。以上数据均利用 Popgene 3． 2 软件进行计算。

　　2 结果

　　2． 1 PCR 扩增结果

　　从 60 个引物 ( p1 ～ p60，上海生工生物工程公司) 中筛选出 25 个扩增重复性好、多态性较高的引物对 3 个实验兔品系进行 RAPD 扩增。表 1 列出了这 25 个随机引物的序列及其在 3 个实验兔品系中的扩增结果，共检测到 493 个扩增片段，长度在 100～ 1800 bp 之间。结果显示 WHBE 兔的扩增条带数最多( 182) ，其次是 JW 兔( 164) ，条带最少的是NZW 兔( 147 ) ; JW 兔与 NZW 兔的共有条带数最多，WHBE 兔与 JW 兔的共有条带数比 WHBE 兔与NZW 兔的共有条带数多。
　　
　　2． 2 遗传多样性结果

　　3 个群体位点数为 228 ～ 234 个不等，多态位点数在 94 ～ 166 个不等，多态位点比例在 40． 69% ～70． 94% 之间，Shannon 指数为 0． 1905-0． 3385 ( 表3) 。WHBE 兔的多态位点比例和 Shannon 多样性值在三个群体中均为最高，说明 WHBE 兔相对于 JW兔和 NZW 兔而言具有较高的遗传多样性水平。【表略】

　　2． 3 遗传相似性结果

　　群体间的遗传距离和遗传相似系数见表 4，JW兔与 NZW 兔的遗传相似系数最高，为 0． 8443，WH-BE 兔与 JW 兔的遗传相似系数为 0． 8204，高于 WH-BE 兔与 NZW 兔的遗传相似系数( 0． 7862) ; JW 兔与 NZW 兔的遗传距离最小( 0． 1557) ，WHBE 兔和JW 兔之间的遗传距离 ( 0． 1796 ) 小于 WHBE 兔和NZW 兔之间遗传距离( 0． 2138) 。【表略】
　　
　　3 讨论

　　随机扩增多态性 DNA 技术( random amplifiedpolymorphic DNA，RAPD) 是 1990 年由 Willams 和Welsh 几乎同时发展起来的一项基于 PCR 技术的DNA 分子水平上的大分子多态性检测技术。

　　因其具有简便、快速、经济、需样量少和多态性好等特点，受到广泛关注。近年来，此技术已成功应用于遗传多样性检测、基因定位、品系鉴定、医学诊断、遗传图谱构建和系统学研究等诸多领域。

　　家兔的 RAPD 标记多态性丰富，RAPD 技术能迅速而较准确地提供大量的遗传标记，将不同品系加以区分。陈民利等选用 10 个随机引物对 3 个实验兔品系共 22 个样本 DNA 样本进行了RAPD 扩增，可扩增出不同品系之间共有的条带和各自的特征条带，可将 WHBE 兔与日本大耳白兔和新西兰兔品系很好地区分开来。赵立虎等从 7套共 140 个随机引物中筛选出 10 个多态性较高的引物用于新西兰白兔、青紫兰兔和日本大耳白兔 3个品系的 RAPD 鉴定。庞荣清等从25 个随机引物中筛选出 5 个具有较高多态性的引物，分别对 5个群体的 80 只家兔基因组 DNA 进行了 RAPD-PCR扩增，得到了 5 个家兔群体之间的远近不同的进化亲缘关系和聚类结果。Soto 等利用 RAPD 技术从 31 个引物中选用 8 个多态性好的引物用于 Vol-cano 兔( Romerolagus diazi) 的遗传分析。本研究选用了 60 个针对兔的 RAPD-PCR 引物用于本次实验，以获得更多的多态性位点，使结果更趋准确。对三个实验兔品系随机采样，共采集 90 个样品( WH-BE 兔 30 只，JW 兔 30 只，NZW 兔 30 只) ，能均匀覆盖种群内所有的世代和家系，因此，由这些个体得出的实验结果能够真实全面地反映三个种群的遗传多样性。

　　利用筛选出来的 25 条多态性高的引物在 3 个实验兔品系中进行遗传分析，共检测到 493 个扩增片段，长度在 100 ～ 1800 bp 之间。其中 WHBE 兔的多态位点比例和 Shannon 多样性值在三个群体中均为最高，分别为 70． 94% 和 0． 3385，而 NZW 兔的多态位点比例和 Shannon 多样性值在三个群体中最低，分别为 40． 69% 和 0． 1905，说明 WHBE 兔相对于 JW 兔和 NZW 兔而言具有较高的遗传多样性水平，这一结果也证实了中科院上海实验动物中心刚引进的新西兰兔品系个体遗传品质相对较纯。3 个品系实 验 兔 的 遗 传 相 似 系 数 范 围 在 0. 7862 ～0. 8443 之间，其中 WHBE 兔与 JW 兔的遗传相似系数为 0. 8204，高于 WHBE 兔与 NZW 兔的遗传相似系数( 0． 7862) ; WHBE 兔和 JW 兔之间的遗传距离( 0. 1796) 小于 WHBE 兔和 NZW 兔之间遗传距离( 0. 2138) ，这些结果与 WHBE 兔来源于日本大耳白兔，其血缘关系较近相一致。

　　日本大耳白兔和新西兰兔作为特种经济动物在我国饲养已有很长的历史，人为地定向选育，造成了血缘杂交，同时长期的饲养环境改变或特殊的饲养环境导致出现遗传学上的基因突变或漂变，WHBE兔的出现可能就是这种结果，该兔的眼球为黑色，且存在血液学和免疫学上的特点。本次研究用大量引物对该三个品系进行 RAPD 分析，不但可以提供品系鉴定的分子依据，还可以结合其它标记方法进行目的基因的克隆和标记辅助选择，为 WHBE 兔的遗传育种及其在医学领域中的应用提供参考。

　　参 考 文 献
　　
　　［1］ 寿旗扬，陈民利，朱科燕，等． WHBE 兔血液流变学及凝血功能测定及分析［J］． 实验动物与比较医学，2009，29( 6) :415 － 418．
　　［2］ 陈民利，赵伟春，应华忠，等． WHBE 兔遗传特异性的 RAPD分析［J］． 浙江大学学报( 农业与生命科学版) ，2005，31( 4) : 493 －498．
　　［3］ 蔡月琴，屠珏，余佳，等． RAPD 标记技术用于 WHBE 兔近交系培育中的遗传分析［J］． 中国实验动物学报，2009，17( 5) : 326 －329．