动物学论文
哺乳动物卵母细胞冷冻保存研究一直备受人们关注，一方面，冷冻保存卵母细胞是动物遗传资源保存的一种重要手段； 另一方面，随着哺乳动物胚胎工程技术的日益发展，对卵母细胞的数量和质量要求越来越高； 同时，人类辅助生殖研究需要卵母细胞冷冻保存作为技术支撑。到目前为止，人们对多种动物的体细胞冷冻保存技术已经成熟，但是卵母细胞的冷冻保存效率还远低于其他细胞，其原因可能是卵母细胞体积大、细胞膜的结构和渗透性与其他细胞相异、冷冻过程中对冷冻保护剂造成的渗透压变化较敏感等[1].近年来，人们对卵母细胞冷冻保存研究做了细致的探索和研究，提出了很多新技术、新方法和新观点。众所周知，哺乳动物卵母细胞冷冻保存一般包括添加抗冻保护剂、冷冻保存、解冻复苏和洗脱冷冻保护剂等几个步骤，每一步操作都会由于渗透压差造成卵母细胞的体积变化而导致其微结构损伤甚至死亡[2].本文就卵母细胞冷冻保存研究中所涉及的方法、载体、抗冻保护剂和新的研究观点进行综述，为进一步研究和改进卵母细胞冷冻保存技术提供参考。
1 冷冻方法。
冷冻方法是影响卵母细胞冷冻效果的一个重要因素，常用的卵母细胞冷冻方法有慢速冷冻法和玻璃化冷冻法（ 快速冷冻法） 2 种。
1. 1 慢速冷冻方法。
卵母细胞进行慢速冷冻时需要采用程序降温仪，其价格昂贵，操作步骤繁琐，降温时间较长，对卵母细胞解冻后的体外受精率、卵裂率及囊胚发育率影响较大，而且，在冷冻除人以外的动物未成熟卵母细胞时效果并不如意，虽然有移植后获得了成活个体的报道[3,4],但逐步被玻璃化冷冻方法所取代。
Lim 等[5]利用慢速冷冻法冷冻牛卵母细胞的研究表明，成熟与未成熟卵母细胞的抗冻性具有差异，冻融方法影响冷冻卵母细胞解冻后的存活率和发育能力。研究表明[6,7],采用慢速冷冻方法冷冻卵母细胞时，成熟的卵母细胞冷冻后其受精能力、发育率和胚胎质量要明显优于未成熟的。但是在实际生产应用时，往往取得的卵母细胞恰恰是未成熟的，所以其应用范围非常受限。
1. 2 玻璃化冷冻方法。
玻璃化冷冻保存不需昂贵的程序冷冻仪器，但是其效果较慢速冷冻明显行之有效，是目前普遍采用的卵母细胞冷冻方法。其优点是操作简单快捷、降温迅速，能够减少在冷冻过程中形成的冰晶，降温过程中卵母细胞内、外溶液呈玻璃样，从而避免形成冰晶所带来的机械性损伤。但是该方法也存在不可忽视的缺点，因为玻璃化冷冻时添加高浓度的冷冻保护剂容易引起化学中毒[8],一旦操作过慢还可能会引起强烈地渗透损伤，从而破坏卵母细胞骨架结构，导致纺锤体和染色体结构异常，冻融后卵母细胞的存活率、形态正常率、受精率和发育力等有所下降[9].实现玻璃化冷冻通常有 2 条途径，一条是极大地提高冷却速率，另一条是增加保护剂的浓度[10].因此，尽量选择化学毒性小的冷冻保护剂及组合比例以及缩短冷冻液处理时间是玻璃化冷冻效果好坏的关键之一。
2 常用的冷冻载体。
卵母细胞冷冻保存时，为了解冻后回收方便，一般需要将卵母细胞装在载体中冷冻，常用的冷冻载体主要有冷冻细管、开放性拉长细管（ Open PulledStraw,OPS） 和冷冻环（ Cryoloop） 等，也有人用玻璃微管（ Glass micropipette vitrification,GMP） 、封口式拉长细管（ Closed Pulled Straw,CPS） 、塑料微量吸头（ Plastic micropipette） 和电镜铜网 （ electron micro-scope grids,EMG） 等载体[11].选择冷冻载体时尽量选择容纳冷冻液容积较小且热导性较好的，这样冷冻液降温速度快。
2. 1 冷冻细管。
冷冻卵母细胞采用的细管载体通常为冷冻精液所用的麦管。在卵母细胞冷冻研究之初，由于细管冷冻较适宜程序冷冻仪、能够进行批量冷冻而受到广泛关注，并在胚胎冷冻上达到商用水平，但这种载体采用慢速冷冻时同样操作时间较长，需要昂贵的仪器，因为细管温度下降速率受其导热性差所影响，降温相对较慢，容易加大渗透性抗冻保护剂对卵母细胞的毒性损伤，随着冷冻效果越来越被关注和拉长细管的开发使用而逐渐呈被淘汰趋势。