动物肌肉发育中环状RNA的作用探讨

　　摘    要：　环状RNA是一种具有环状结构的非编码RNA,在转录过程中出现,由单链RNA分子通过共价结合形成环形。环状RNA在植物和动物机体中广泛分布,主要承担了与蛋白质结合、调控转录等生物功能,对动物的肌肉发育也有重要的调控作用。文章综述了环状RNA的发现、合成与特征、检测方法及生物学功能,介绍了环状RNA在动物肌肉发育中的研究进展,展望了环状RNA的研究应用前景。

　　关键词：　环状RNA; 内含子; 外显子; 基因表达; 生物功能;

　　Abstract：　CircRNAs is a kind of non-coding RNA with ring structure, which appears in the process of transcription and is formed by covalent binding of single-stranded RNA molecules. The circRNAs are widely distributed in plants and animals, which mainly plays the roles of binding to proteins and regulating transcription, and also plays an important role in the regulation of animal muscle development. In this paper, the discovery, synthesis, characterization, detection methods and biological functions of circRNAs were reviewed. The research progress of circRNAs in animal muscle development was introduced and the prospect of its application was prospected.

　　Keyword：　circRNAs; intron; extron; gene expression; biological function;

　　H. L. Sanger等[1]最先通过分离植物病毒和动物肝炎病毒发现了环状RNA,从此环状RNA被人所认知。环状RNA主要有两种形成机制,一种为外显子环状RNA,另一种为内含子环状RNA,它们都各自有着不同的功能和作用。近年来,人们通过生物学方法和高通量测序方法等检测到了环状RNA并对其生物功能(miRNA海绵、调控转录以及结合蛋白等)进行了深入研究。目前已有很多关于环状RNA对动物肌肉细胞发育、繁殖以及调控方面的研究,但对于环状RNA与miRNA存在相互识别的结合位点以及环状RNA对骨骼肌等的调控作用研究还很少,而这些都将成为未来动物研究的热点。文章综述了环状RNA的发现、合成与特征、检测方法、生物学功能及环状RNA在动物肌肉发育中的研究进展,并展望了环状RNA的研究应用前景,以期对环状RNA的研究及应用提供参考。

　　1、 环状RNA的发现

　　在1976年,H. L. Sanger等[1]率先发现了环状RNA的存在,轰动了学术界。W. R. Jeck等[2]提出早在H. L. Sanger等发现环状RNA之前就有人观察到环状RNA,但由于没有证据,所以不了了之。1979年,M. T. Hsu等[3]在显微镜下观察到在植物细胞中有环状RNA的存在,从而推测在真菌甚至病毒等生物中都普遍存在环状RNA。其后陆续在人[4]、猴子[5]、猪[6]等生物的细胞中检测到了环状RNA的存在以及它们参与重要生命活动的线索。J. Salzman等[7]研究结果表明,环状RNA很有可能是细胞遗传过程当中的重要转录产物。此后,环状RNA逐渐走进人们的视野中,开始成为研究热点。
 

　　2 、环状RNA的合成与特征

　　环状RNA有两种形成机制,一种为外显子发生跳读,从而发生索套结构产生驱动作用,另一种为内含子互补配对发生驱动环化[8]。W. R. Jeck等[8]使用Map-Splice分段读取算法,检测并且识别到了反向链接的片段。S. Memczak等[9]的研究结果表明,外显子环化是大多数环状RNA的形成方式。通常RNA由5′端头部和3′端尾部组成,而这种机制下形成的环状RNA是通过首尾反向互补链相连,即5′端与3′端相连[4,10],从而形成外显子环化。同时, Zhang X. O. 等[11]用特殊的RNase R对环状RNA处理之后进行PCR扩增,发现大量环状RNA存在于人体胚胎干细胞H9内。

　　2.1、 外显子环化

　　在科学家对外显子环化的研究中,衍生出了两种假设,一种是RNA内部剪切,内含子被去除从而发生RNA序列环化。这是由于RNA出现了局部折叠现象,使得外显子在转录过程中发生跳读,并生成一个外显子包裹内含子的环状RNA套索结构。而另一种则是由于环状RNA的前体在合成过程中出现反向互补[12,13]。

　　2.2、 内含子驱动环化

　　基于这种机制所形成的环状RNA,在内切酶的影响下,其内含子的套索结构形成后发生脱酚作用从而发生相应的退化[7,14]。但是一些研究结果显示,某些含有特定序列的内含子不会出现脱酚反应,从而不能形成来源于内含子的环状RNA。有研究结果表明,由于环状RNA在被脱支酶或无介导降解机制作用后,产生的产物和中间体会变得不稳定易衰亡[15],因此内含子驱动环化的形成机制和外显子跳读的形成机制不易区分。

　　2.3、 环状RNA的特性

　　因为认知和技术方面的限制,初期对环状RNA的研究十分有限。但根据当前的研究发展来看,环状RNA在生命活动中的地位举足轻重。经过科学家验证,环状RNA包含两种重要特性:1)广泛性。J. Salzman等[7]使用RNA高通量测序法发现10%的人体基因能转录出环状RNA,大致与链型RNA的转录量差不多。S. Memczak等[9]研究结果表明,在不同种类人体细胞中已经发现了上千种环状RNA,对小鼠RNA的分析也同样揭示了成千上万个明显的循环转录组。2)稳定性。环状RNA在细胞中非常稳定,其半衰期是mRNA的四倍多[10,16]。环状RNA的成环位置由2′～5′的磷酸二酯键相连,因此环状RNA对RNA脱支酶有一定抗性[16]。

　　3 、环状RNA的检测

　　由于大部分的环状RNA都是由外显子成环机制构成的,因此文章主要介绍外显子环化所形成的环状RNA的检测方式。

　　3.1 、生物学方法

　　由于环状RNA呈环形,两端互补链接,结构较为稳定,相较于一般RNA,环状RNA在电泳中移动得较慢,因此可以使用增强型交联凝胶法放大效果[17]。环状RNA含有较少的总核苷酸序列,使得其在弱交联凝胶中移动缓慢。生物学检测方法主要有三种,即诺瑟杂交法、电泳法以及酶法。1)诺瑟杂交法[18]:该方法从细胞或者样本中提取到其RNA序列,然后再使用纤维素层析分离出带有poly(A)尾的真核mRNA;再将其置入凝胶电泳中,通过电泳分离RNA样品。由于凝胶容易被破坏,探针不能轻易进入到RNA基质中,因此通过吸管(毛细管)将分离出来的RNA样品放置到尼龙膜上进行进一步分析。2)双向凝胶电泳法和琼脂糖电泳:相对于低交联的凝胶电泳,环状RNA在高度交联的电泳中有着更低的迁移率。环状RNA与融化的琼脂糖混合后,被交叉连接所困,导致其在电泳过程中不发生迁移,从而能测定环状RNA[19]。3)酶法[20,21]:虽然外显子核酸内切酶RNase R、酸性磷酸酯酶和外显子核酸终止子外切酶这三种酶无法作用于环状RNA,但可以用于降解直链型RNA,因此通过这三种酶可以对特定RNA种类进行量化,从而揭示环状RNA丰富的种类。

　　3.2、 高通量测序法

　　传统经典的分子生物学检测法在环状RNA的功能验证上具有重要作用,但对发现物种新的环状RNA效果欠佳,而高通量测序法的出现则解决了这一困境。环状RNA是通过反向剪接产生的,但是利用原始算法无法准确判断出RNA反向剪接的位点和相应的环状结构。目前可应用于环状RNA分子研究计算的方法有segemehl[22]、CircSeq[9]、Map-Splice[23]等。高通量测序法可以定位末端,测出腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的顺序,从而达到准确测序的目的[24]。

　　4、 环状RNA的生物学功能

　　在对基因组的分析过程中,发现了大量的外显子环状RNA。环状RNA不仅对物种的多样性以及进化保守性的调控起重要作用,而且在细胞调控和繁殖中也发挥着重要的生物学作用[13]。

　　4.1、 miRNA海绵

　　研究结果表明,在miR-7和miR-138的存在下,从人和小鼠的CDR1as/ciRS-7中所得到的环状RNA和小鼠Y染色体(sex-determining Region on the Y Chromosome, Sry)与miRNA的受体蛋白密切相关[9,21]。CDR1as/ciRS-7包含74个miRNA结合位点,而环状RNA Sry包含16个miR-138的结合位点。miRNA的结合不会破坏这两个特殊的RNA,相反,它会与miRNA和目标编码基因发生结合,从而降低miRNA介导的后转录抑制的作用。结果表明,过表达CDR1as/ciRS-7或Sry的环状RNA增加了miRNA靶向结构的表达,从而起到了负调节的作用。以上结果是由T. B. Hansen等[25]对小鼠Y染色体的非同源区段(Sry sex-determining region)进行miRNA海绵翻译程度的研究所得出的重要推论。大量试验结果表明,环状RNA不存在大量的miRNA结合位点[26],推翻了当时提出的miRNA海绵和环状RNA在功能上没有差异的理论。

　　4.2、 调控转录

　　环状RNA可以通过调控亲代基因模版链,从而调控转录过程。由于环状RNA可以被认为是选择性剪切的异构体,因此它们可能会在基因表达水平上起到调节作用,其中可能有两种情况:1)形成多种能翻译得到功能性蛋白质的miRNA的异构体;2)减少规模化拼接的模板链。由于没有足够的证据证明存在有可以直接发生转录的环状RNA,所以第一种情况不太可能实现。Li Z. 等[27]研究结果表明,从细胞核中检测到了内含子环状RNA以及RNA聚合酶的存在,而聚合酶可以作用于环状RNA,从而减少规模化拼接的模板链,进而起到调控转录的作用;同时还发现了一种由内含子组成的一类环状RNA,被称为环状长链非编码RNA,并指出此类RNA参与了转录调控的过程。R. Ashwal-fluss等[28]研究结果表明,亲代基因中的cis会被环状RNA调控支配,而这也是环状RNA参与调控的一种机制。在剪切过程中,环状RNA与对应呈线性关系的U1 snRNP相互作用,从而使亲代基因中的cis含量发生上调。

　　4.3、 结合蛋白质

　　环状RNA可以与蛋白质相结合从而参与生命活动。例如,环状RNA可以与AGO蛋白结合[9]。环状RNA可以与RNA聚合酶Ⅱ相结合[8],同时还可以与甘露糖结合凝集素相结合[9],表明环状RNA可能起到了支撑结构的作用,同时也表明环状RNA对转录具有调节作用。一些环状RNA可以通过其翻译的内部核糖体进入识别点(IRES)从而进行翻译,并且只要一个识别点以及ATG的环状RNA就可以进行翻译。例如:环状RNA参与了甲型肝炎病毒和乙型肝炎病毒等的合成[29]。

　　5、 环状RNA在动物肌肉发育中的研究进展

　　5.1、 环状RNA在牛肌肉发育中的研究进展

　　魏雪峰[30]通过高通量测序技术在不同生长时期的秦川牛(90天和24个月)肌肉中检测到两个年龄段共同存在的环状RNA有2 400个,包含828个差异表达,其中circLMO7的表达程度较高;circLMO7通过与miR-378a-3p结合,使靶基因HDAC4再次表达,从而促使肌细胞增殖,抑制其分化。Zhang C. L. 等[31]发现,除了激素和蛋白质以外,非编码RNA分子在牛奶蛋白质合成中也起着重要调节作用,其中环状RNA通过调控其亲代基因从而进行表达;利用RNA-seq的deep RNA测序技术,对比了产后90天和250天母猪乳腺分离出来的RNA样本,得到4 084个环状RNA,其中只有2 231个环状RNA在哺乳期共同表达,表明环状RNA有着高度的阶段特异性。经过测定,共有80个环状RNA来自于牛乳腺中的4个酪蛋白编码基因(CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3),其中来自于CSN1S1的环状RNA有着较高的丰度[31]。这些环状RNA在miRNA-2 284序列存在一些靶点,并以CSN1S1和CSN2 mRNA作为目标RNA,表明环状RNA可能参与酪蛋白的表达调控。

　　5.2、 环状RNA在猪肌肉发育中的研究进展

　　Liang G. 等[32]对比了0,30,240日龄猪的骨骼肌,结果表明在0～30 日龄,环状RNA对骨骼肌的生长发育以及肌纤维类型转换进行了调控;在30～240日龄时,环状RNA对骨骼肌糖代谢和钙离子信号进行了调控,说明环状RNA对肌肉生长有着直接的联系。Sun J. 等[33]通过Ribo-Zero RNA测序技术,在长白猪和蓝塘猪中检测到了4 360个环状RNA存在差异表达,而其中分别来自93个功能性宿主基因的236个环状RNA参与了肌细胞的生长。该试验发现了一种新的转录后调节机制,未来可以对肌纤维在不同品种猪中的发育进行更深入研究。

　　5.3、 环状RNA在羊肌肉发育中的研究进展

　　Li C.等[34]在羊胚胎时期的背最长肌(LDM-E)以及成年时期的背最长肌(LDM-A)的RNA序列中总共发现了5 086个环状RNA的差异性表达,包括2 940个上调环状RNA和2 146个下调环状RNA,背最长肌中环状RNA的实时定量PCR分析结果表明,circRNA 00002456、circRNA 0000552、circRNA 00004676、circRNA 00004690以及circRNA 0000666的表达在LDM-E中相对高于LDM-A,相反circRNA 0005256、circRNA 0003451、circRNA 0005243以及circRNA 0005250的表达在LDM-A中相对高于LDM-E。从而证明了环状RNA在羊肌肉中的差异性表达。Cao Y. 等[35]从绵羊骨骼肌RNA基因库中提取到7 550万个序列;这些序列被绘制到绵羊的参考基因组中的729个基因上,总共发现了886种环状RNA,其中包括许多内含子环状RNA和外显子环状RNA。逆转录PCR和DNA测序分析证实了多种环状RNA的存在,也证明了绵羊环状RNA对RNase R的消化具有抗性。最终发现大部分环状RNA通过与肌肉特异性miRNA相互作用,从而参与肌肉生长发育的调控,尤其是circ776。GO基因富集分析和KEGG富集分析结果表明,环状RNA的宿主基因参与肌细胞的发育和信号传导。

　　6 、发展前景

　　目前环状RNA是一个非常热门的研究课题,它的发现引起了学术界的重视,也逐渐揭开了它的神秘面纱。环状RNA具有独特的生物功能,在生物的生长、发育、衰老等生命活动中起到了非常重要的调控作用。同时,由于它的丰富性和保守性等特性的存在,使它成为了新型生物载体。目前科研人员对环状RNA的研究还在继续深入,相信随着生物科技的进步和未来对环状RNA越来越深入的研究将会在医学以及动植物基因表达功能研究中起到非常重要的作用。

　　参考文献

　　[1] SANGER H L,KLOTZ G,RIESNER D,et al.Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures [J].Proc Natl Acad Sci USA,1976,73(11):3852-3856.
　　[2] JECK W R,SHARPLESS N E.Detecting and characterizing circular RNAs [J].Nat Biotechnol,2014,32(5):453-461.
　　[3] HSU M T,COCA-PRADOS M.Electron microscopic evidence for the circular form of RNA in the cytoplasm of eukaryotic cells [J].Nature,1979,280(5720):339-340.
　　[4] CAPEL B,SWAIN A,NICOLIS S,et al.Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis [J].Cell,1993,73(5):1019-1030.
　　[5] ABDELMOHSEN K,PANDA A C,DE S,et al.Circular RNAs in monkey muscle:age-dependent changes [J].Aging (Albany NY),2015,7(11):903-910.
　　[6] VEN M T,HANSEN T B,VEN S T,et al.Spatio-temporal regulation of circular RNA expression during porcine embryonic brain development [J].Genome Biol,2015,16:245.
　　[7] SALZMAN J,GAWAD C,WANG P L,et al.Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types [J].PLoS One,2012,7(2):e30733.
　　[8] JECK W R,SORRENTINO J A,WANG K,et al.Circular RNAs are abundant,conserved,and associated with ALU repeats [J].RNA,2013,19(2):141-157.
　　[9] MEMCZAK S,JENS M,ELEFSINIOTI A,et al.Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency [J].Nature,2013,495(7441):333-338.
　　[10] PETKOVIC S,MULLER S.RNA circularization strategies in vivo and in vitro [J].Nucleic Acids Res,2015,43(4):2454-2465.
　　[11] ZHANG X O,WANG H B,ZHANG Y,et al.Complementary sequence-mediated exon circularization [J].Cell,2014,159(1):134-147.
　　[12] ZAPHIROPOULOS P G.Circular RNAs from transcripts of the rat cytochrome P450 2C24 gene:correlation with exon skipping [J].Proc Natl Acad Sci USA,1996,93(13):6536-6541.
　　[13] 刘军强,吴慧,朱诗琪,等.环状RNA的研究进展 [J].江苏师范大学学报,2016,34(1):47-52.
　　[14] RODRIGUEZ-TRELLES F,TARRIO R,AYALA F J.Origins and evolution of spliceosomal introns [J].Annu Rev Genet,2006,40:47-76.
　　[15] CHEN I,CHEN C Y,CHUANG T J.Biogenesis,identification,and function of exonic circular RNAs [J].Wiley Interdiscip Rev RNA,2015,6(5):563-579.
　　[16] SCHWANHAUSSER B,BUSSE D,LI N,et al.Global quantification of mammalian gene expression control [J].Nature,2011,473(7347):337-342.
　　[17] TABAK H F,VAN DER HORST G,SMIT J,et al.Discrimination between RNA circles interlocked RNA circles and lariats using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis [J].Nucleic Acids Res,1988,16(14A):6597-6605.
　　[18] TRAYHURN P.Northern Blotting [J].Proc Nutr Soc,1996,55(1B):583-589.
　　[19] KRYNDUSHKIN D S,ALEXANDROV I M,TER-AVANESYAN M D,et al.Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104 [J].J Biol Chem,2003,278(49):49636-49643.
　　[20] SUZUKI H,ZUO Y,WANG J,et al.Characterization of RNase R-digested cellular RNA source that consists of lariat and circular RNAs from pre-mRNA splicing [J].Nucleic Acids Res,2006,34(8):e63.
　　[21] HANSEN T B,JENSEN T I,CLAUSEN B H,et al.Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges [J].Nature,2013,495(7441):384-388.
　　[22] WANG K,SINGH D,ZENG Z,et al.Map Splice:accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery [J].Nucleic Acids Res,2010,38(18):e178.
　　[23] HOFFMANN S,OTTO C,DOOSE G,et al.A multi-split mapping algorithm for circular RNA,splicing,trans-splicing and fusion detection [J].Genome Biol,2014,15(2):R34.
　　[24] SZABO L,MOREY R,PALPANT N J,et al.Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development [J].Genome Biol,2015,16:126.
　　[25] HANSEN T B,WIKLUND E D,BRAMSEN J B,et al.miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA [J].EMBO J,2011,30(21):4414-4422.
　　[26] GUO J U,AGARWAL V,GUO H,et al.Expanded identification and characterization of mammalian circular RNAs [J].Genome Biol,2014,15(7):409.
　　[27] LI Z,HUANG C,BAO C,et al.Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus [J].Nat Struct Mol Biol,2015,22(3):256-264.
　　[28] ASHWAL-FLUSS R,MEYER M,PAMUDURTI N R,et al.circRNA biogenesis competes with pre-mRNA splicing [J].Mol Cell,2014,56(1):55-66.
　　[29] CHEN C Y,SARNOW P.Initiation of protein synthesis by the eukaryotic translational apparatus on circular RNAs [J].Science,1995,268(5209):415-417.
　　[30] 魏雪峰.miR,378a-3p,miR-107和相关circRNA调控牛肌细胞发育的机制研究[D].杨凌:西北农林科技大学,2017.
　　[31] ZHANG C L,WU H,WANG Y,et al.Circular RNA of cattle casein genes are highly expressed in bovine mammary gland [J].J Dairy Sci,2016,99(6):4750-4760.
　　[32] LIANG G,YANG Y,NIU G,et al.Genome-wide profiling of Susscrofa circular RNAs across nine organs and three developmental stages [J].DNA Res,2017,24(5):523-535.
　　[33] SUN J,XIE M,HUANG Z,et al.Integrated analysis of non-coding RNA and mRNA expression profiles of 2 pig breeds differing in muscle traits [J].J Anim Sci,2017,95(3):1092-1103.
　　[34] LI C,LI X,YAO Y,et al.Genome-wide analysis of circular RNAs in prenatal and postnatal muscle of sheep [J].Oncotarget,2017,8(57):97165-97177.
　　[35] CAO Y,YOU S,YAO Y,et al.Expression profiles of circular RNAs in sheep skeletal muscle [J].Asian-Australas J Anim Sci,2018,31(10):1550-1557.