观察鸡嗉囊中淋巴细胞的定位分布及数量变化

　　随着鸡黏膜免疫研究的深入，鸡黏膜免疫组织学内容亦趋完善。大量研究表明，禽类肠相关淋巴组织由肠道中集合的淋巴组织和散在的淋巴细胞一起构成。前者包括食管扁桃体、幽门扁桃体、盲肠扁桃体等，后者则为分布在各肠段中的散在的淋巴细胞，其主要分布于消化道、前胃、回肠和直肠等组织中.嗉囊作为食物的最初储存场所，能使禽类摄取的食物保持适当的温度和湿度，并对其进行浸润与软化，利于胃肠道对食物进一步消化吸收。试验表明，切除嗉囊后鸡消化能力明显下降，并且更容易出现细菌感染等疾病，提示嗉囊对于食物中的微生物具有初步的抵御作用.

　　冯小刚等于 2013年通过免疫组织学方法发现鸡嗉囊中亦有大量的淋巴细胞分布，并将其归为肠相关淋巴组织中的重要组成部分。鉴于此，本试验对鸡嗉囊的淋巴细胞做进一步研究。旨在观察鸡嗉囊中淋巴细胞的定位分布及数量变化情况，探索嗉囊免疫基础的建立过程，从而为肠相关淋巴组织的完善增添新的内容，同时也为疫苗的研发和嗉囊疾病的治疗提供理论依据。

　　1 材料与方法
　　
　　1.1 试验样品
　　将 100枚清洁级海蓝白种蛋进行孵化，鸡出壳后置于动物室中常规饲养。分别在出壳后 1、4、7、10、14、21、35及 56日取材。每次取 7只鸡新鲜嗉囊的相同部位，置于蛋白包埋液（OCT）中包埋后进行低温切片，片厚 5μm.-80℃超低温冰箱保存备用。

　　1.2 抗体
　　试验所用单克隆抗体见表 1.【表1】

　　
　　1.3 试剂和仪器
　　日本樱花蛋白包埋剂（OCT），AAF液，丙酮，伊红和 3-氨丙基 -3-乙氧基甲硅烷（APES）等。Lei-caCM1850冰冻切片机，UltraSensitiveTM SP超敏试剂盒 kit-9710（福州迈新公司），OlympusCX41显微镜，Image-proPlus5.1图像分析软件（美国 MediaCybernetics公司），Pixerapro150ES图像采集器。

　　1.4 试验方法
　　取嗉囊切片，做以下处理：滴加过氧化物酶阻断溶液（试剂 A），室温下孵育 10min,以阻断内源性过氧化物酶的活性；PBS洗 3次，各 3min;滴加正常非免疫动物血清（试剂 B）封闭，室温下孵育 10min;滴加相应稀释单抗工作液 50μL,4℃条件过夜；PBS洗 3次，各 3min;滴加生物素标记的第二抗体（试剂C），室温孵育 10min;PBS洗 3次，各 3min;滴加链霉素抗生物素 -过氧化物酶溶液（试剂 D），室温下孵育 10min;PBS洗 3次，各 3min;DAB显色；苏木精复染；脱水；透明；镜检封片、照相。

　　1.5 图像分析及统计学处理
　　对各抗体阳性细胞进行分析，并选择放大倍数为 100的图片，采用 Image-proPlus5、1图像分析软件对单位视野内的免疫组织化学阳性细胞的面积进行测定。对每个抗体对应的各个部位的切片随机选定 5个视野，然后求平均值。采用 SPSS19、0单因素方差分析进行统计分析。

　　2 结果与分析
　　
　　2.1 CD3+细胞的发育规律
　　出壳后 1日龄时，可见少量 CD3+细胞分布于嗉囊黏膜固有层的小血管周围（图 1a）；4日龄时，CD3+细胞数量增多，散布于黏膜固有层与黏膜下层；7日龄时，首次观察到以 T细胞为中心的淋巴聚集物（图 1b），且有部分 CD3+细胞分布于沿黏膜上皮下区域；27日龄时，部分 CD3+细胞出现在腺体周围，并向腺体上皮突入；35日龄时，CD3+细胞出现在黏膜上皮中，形成嵌有淋巴细胞的黏膜上皮，同时，腺体与上皮间固有层中出现弥散的淋巴聚集物（图1c）。56日龄时，血管周围阳性细胞较少，但淋巴聚集物增多，黏液腺上皮受淋巴细胞浸润明显，且部分腺体上皮和黏膜上皮转化为淋巴上皮（图 1d）。

　　CD3+细胞于 1日龄时即出现，随后于 4日龄明显增多（P<0、05），其后逐渐增多，并于 21日龄时再次明显增多（P<0、05），随后 CD3+细胞增加缓慢，呈稳定水平（图 2）。

　　2.2 CD4+细胞的发育规律
　　1日龄时，少量的 CD4+细胞出现在嗉囊固有层的血管周围（图 1e）；4日龄时，固有层中的 CD4+细胞数量明显增多；7日龄时，观察到 CD4+细胞出现在食管腺周围，并有向腺体内部突入趋势（同 CD3+细胞一样，首次观察到含 CD4+细胞的淋巴聚集物）；21日龄时，CD4+细胞于滤泡间区域聚集，并发生明显浸润至腺体的现象；35日龄时，分布于聚集物的CD4+细胞，一部分位于滤泡外区域，而另一部分依然位于聚集物中心（图 1f、1g）；56日龄时，部分CD4+细胞围绕在腺体周围，使部分腺体上皮转化为淋巴上皮（图 1h）。

　　CD4+细胞于 1日龄能够被观察到，4日龄时增加明显（P<0、05），随后小幅上升，并于 21日龄时再次显着升高（P<0、05），之后数量逐渐趋于稳定水平（图 2）。

　　2.3 CD8+细胞的发育规律
　　1日龄时，单个 CD8+细胞出现在嗉囊黏膜固有层和肌层中，偶在上皮基底层见单个阳性细胞分布；4日龄时，多数散在的 CD8+细胞围绕在固有层的小血管周围（图 1i），上皮基底层可见单个阳性细胞浸润；14日龄时，CD8+细胞逐渐向上皮内迁移（图1j）；27日龄时，固有层中的阳性细胞多聚集在血管周围和腺体与上皮间区域；35日龄时，浸润上皮基底层的阳性细胞增多（图 1k）；56日龄时，部分上皮和腺体上皮被 CD8+细胞浸润，使其转化为淋巴上皮。在弥散淋巴组织中也有丰富的 CD8+细胞聚集，而固有层中的阳性细胞分布渐少（图 1l）。

　　CD8+细胞数量在 4、14日龄时显着增加（P<0、05）；而在 21日龄时有所减少，但不显着（P>0、05）；27日龄时，CD8+细胞数量显着增加（P<0、05）；至 56日龄逐步增加，但变化不显着（P>0、05）（图 2）。

　　2.4 Bu-1b+细胞的发育规律
　　4日龄时，极少数的 Bu-1b+细胞出现在嗉囊黏膜固有层中；7日龄时，在固有层小血管周围和腺体与上皮间固有层中发现少数的 Bu-1b+细胞 （图1m），此时 Bu-1b+细胞在其他部位分布仍极少；14日龄时，Bu-1b+细胞的分布较之前日龄分布更广，散在分布于固有层中；27日龄时，Bu-1b+细胞初步形成聚集区，但上皮并未出现阳性细胞浸润；35日龄时，出现了以 Bu-1b+细胞为中心的淋巴聚集物和大量散在的阳性淋巴细胞，上皮也出现少量 Bu-1b+细胞浸润（图 1n）；56日龄时，Bu-1b+细胞以散在的和聚集的形式大量分布于上皮下的固有层中，但上皮浸润依旧仅发生在聚集物和腺体上方的上皮基底层中（图 1o）。

　　4~21日龄，Bu-1b+细胞的数量呈增长趋势，但并不显着（P>0、05）；27日龄时，Bu-1b+细胞数量急速增长（P<0、05）；35日龄时，Bu-1b+细胞的数量也显着增加（P<0、05）；35与 56日龄，Bu-1b+细胞的数量有所上升，但不显着（P>0、05）（图 2）。【图2】

　　
　　3 讨论与结论
　　
　　肠相关淋巴组织同呼吸道相关淋巴组织、生殖道相关淋巴组织一起构成了禽类体内共同黏膜免疫的防御系统。根据 Castelyn等报道，鸡肠相关淋巴组织由食管扁桃体、幽门扁桃体、回肠派氏结及盲肠扁桃体等肠道集合淋巴组织以及散在于食管、腺胃、十二指肠、回肠及泄殖腔等组织中的淋巴细胞共同组成。然而，嗉囊作为鸡食管的一个重要组成部分，时刻受到夹杂于食物中大量的物理性、生物病原体的侵扰。冯小刚等发现鸡嗉囊中亦有大量淋巴细胞分布，并将其划归为肠相关淋巴组织中的一个不可缺少的部分。基于此，本研究结合禽类免疫学与发育学，通过免疫组织化学方法观察鸡嗉囊免疫活性细胞发育的日龄相关性变化，阐述 B、T淋巴细胞及其亚群的分布，迁移定位和数量变化情况。

　　本研究发现，1日龄时，CD3+、CD4+和 CD8+细胞即已出现，Bu-1b+淋巴细胞于出壳后 4日龄时出现。定位分布上，CD3+细胞主要分布于黏膜上皮基底层及固有层中，以 CD3+细胞为中心的淋巴聚集物首次出现在 7日龄；CD4+细胞主要分布于固有层中；CD8+细胞最初主要分布在黏膜固有层中，随日龄增长逐渐向上皮方向突入，最终形成淋巴上皮；Bu-1b+细胞主要分布于黏膜固有层中，特别是在小血管周围。35日龄时，观察到以 Bu-1b+细胞为中心的生发中心。并且 CD3+、CD4+细胞数量于 4日龄开始显着持续增加，这与 Friedman等报道的法氏囊与胸腺 T淋巴细胞在 4日龄时发生第 2次迁移至肠道的结果相一致，表明此时 T淋巴细胞已经发育成熟。而在 14日龄（CD3+和 CD4+细胞）和 21日龄（CD8+细胞）时阳性细胞数量略有下降，这与栾维民等及杨树宝等对食管扁桃体、盲肠扁桃体等发育研究结果基本一致。此外本研究还发现，在嗉囊中多存在有淋巴浸润而转化成的淋巴上皮，主要包括部分黏膜淋巴上皮和腺上皮，分析其可能与嗉囊特有的腔状结构有关。嗉囊为鸡饱腹后的储食场所，时刻受到来自食物中的大量病原体的侵扰，所以要求其在润湿食物的基础上同时能够抵御食源性抗原的不利影响。由 CD3+、CD8+细胞浸润转化而成的黏膜淋巴上皮能够抵御来自腔内的部分细菌及病原体的侵扰，逃过此屏障进一步浸入黏膜的微生物则会遭遇腺上皮转化而来的淋巴上皮的再次抵制，诱发局部黏膜免疫。

　　本试验中虽未见大量淋巴生发中心的出现，但的确有较多的淋巴聚集物存在，同时 Bu-1b+细胞的数量随着日龄增长呈上升趋势，这与之前的报道有所差异.试验证明，生发中心的出现与病原体侵染相关，表现为黏膜受到外界刺激时，黏膜内 B淋巴细胞受到刺激后，局部代谢增强，细胞快速增殖，形成生发中心，进而引起免疫应答。本研究中，可能由于饲养环境单一，试验鸡未接触大量流行病原体，故不能引起大量的生发中心产生。同时，也可能与消化道免疫的基础有关。有研究报道，鸡消化道中免疫系统早期以 T淋巴细胞免疫反应为主，其细胞数量增长趋势远大于 B淋巴细胞。而到 6周龄后，B淋巴细胞的数量显着增加并大于 T淋巴细胞数量，表现为以B淋巴细胞免疫为主，这亦可能是早期未见大量生发中心，而 Bu-1b+细胞却一直增加的原因.有趣的是，本试验在鸡出壳后 7~56日龄间均能观察到以 T淋巴细胞为中心，而 B淋巴细胞围绕在周围的独特淋巴聚集物。通过对比前人的研究结果，在肠道中仅有腺胃和法氏囊中出现了此种情况,而本试验的研究对象嗉囊，同前胃一样为消化道中仅有的拥有较大直径的空腔状器官，这可能是出现共同结果的一个原因，但具体分布原因尚需进一步深入研究。本试验结果表明，嗉囊不仅是鸡储存食物的第一场所，亦具有肠黏膜免疫的基础---即由淋巴细胞和淋巴聚集物构成的免疫防线。同时，嗉囊淋巴细胞的迁移规律和分布情况，同其他肠组织淋巴细胞迁移和定位情况相一致，进一步验证了嗉囊可能是肠相关淋巴组织中的一个重要组成部分。同时，本试验描述了嗉囊淋巴细胞的发育情况，分析了嗉囊免疫系统的建立和发生，为治疗嗉囊病以及鸡疫苗的研发，进行实时性免疫提供理论依据。