意大利蜜蜂幼虫发育中期胸部神经节的结构和发育特点

　　昆虫的腹神经索(ventral nerve cord)位于消化道腹面,包括头部的咽下神经节(suboesophageal gangli-on,SOG)、胸部(胸神经节thoracic ganglia,TG)和腹部(腹神经节abdominal ganglia,AG)的一系列神经节和神经索。体神经节对应于其相应的体节,前后两端以神经索与相邻的神经节相连,有相对的独立性,成为各体节的神经中枢。胸神经节是足和翅的活动中心,并有一定程度的自主调节性。

　　3龄幼虫是昆虫胚后发育过程中的一个重要阶段,在这个时期,昆虫幼虫的各个组织器官都在快速的生长发育,细胞的有丝分裂活动旺盛,尤其是神经系统内神经细胞的快速分裂增殖,形成了昆虫幼虫的神经系统,为后续蛹以及成虫神经系统的构成打下了结构基础。关于昆虫腹神经索胚后发育的特点,国内外的学者进行过一些研究。

　　Tyrer和Gregory对3种蝗虫Chortoicetes terminifera、Schistocera gregaria和Locus-ta migratoria咽下神经节和胸部的神经节的神经组织学结构进行了比较研究;Prokop和Technau对果蝇Drosophila melanogaster胚后发育过程中成神经细胞的起源进行了研究;Ito等对果蝇胚胎和幼虫早期腹神经索神经胶质细胞的类型和发育进行了观察。本研究通过形态解剖、BrdU免疫组织化学(5-bromo-2-de-oxyuridine incorporation,BrdU)等技术,对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica幼虫发育中期胸部3个神经节的结构和发育特点进行了研究,为昆虫神经系统的结构及发育特征的研究提供一定的理论证据。

　　1、材料与方法

　　1.1实验材料

　　实验所用的意大利蜜蜂幼虫、蛹均购自秦岭沣峪蜜蜂养殖户,所取材料均来自同一蜂群。幼虫(larva,L)共5龄(L1"L5),根据戴氏定律(Dyar's law),每一头幼虫的龄期通过测量头壳的宽度来决定;蛹(pupa,P)期约9d(P1"P9)。

　　1.2研究方法

　　1.2.1组织化学意大利蜜蜂工蜂的幼虫和蛹多聚甲醛4℃固定过夜。梯度酒精脱水,二甲苯透明。石蜡包埋,横向或纵向连续切片,切片厚度5#7μm,切片裱于涂有多聚赖氨酸的载玻片上,烘干备用。切片脱蜡后复水,HE染色,OLYMPUS(BX51)显微镜观察拍照。

　　1.2.2 BrdU掺入处理对取得的蜜蜂幼虫和蛹的活体,从腹部注射约3μL浓度为25mg/mL的BrdU(B9002,Sigma)。

　　1.2.3 BrdU免疫组织化学染色将BrdU处理过的1-5龄幼虫和1"8d蛹各3#5头,4%多聚甲醛4℃固定8h。70%,80%,90%,95%和100%梯度酒精脱水,石蜡包埋,横向连续切片,厚度为7μm。切片裱于涂有多聚赖氨酸的载玻片上,烘干备用。

　　切片用二甲苯脱蜡,入梯度酒精复水;抗原修复,PBS洗3次;3%过氧化氢封闭内源性酶10min,TBS洗3次;滴加正常山羊血清封闭液,37℃30min;滴加小鼠BrdU单克隆抗体(1/200)(ab8039,ABCAM),湿盒中4℃孵育过夜,PBS洗3次。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG,37℃120min,PBS洗3次;滴加过氧化物酶37℃孵育30min,PBS洗3次;DAB显色后镜检,中性树胶封片,Nikon数码显微成像系统(DS-5M)拍照。阴性对照以PBS代替一抗。

　　2、结果

　　意大利蜜蜂在3龄幼虫阶段,胸部具有3个独立的神经节(图版:A,B,C)。在每一个神经节的侧面和腹面靠近边缘的位置,能看到大的成神经细胞(neuroblast,NB),直径约1.6±0.3μm,它们通过不对称的细胞分裂方式形成的神经节母细胞(ganglion mother cells,GMCs)。GMCs排列成串,朝向神经纤维网的方向(图版:D,E)。BrdU标记显示,在这个时期细胞的分裂活动并不活跃,只在神经纤维网周围以及神经节周围有少数的神经胶质细胞处于分裂阶段(图版:F,G);此外,在成神经细胞周围,能看到极少数的神经节母细胞正在分裂(图版:G)。到蛹发育的第5天(P5),胸神经节的发育基本完成,神经纤维网占据了神经节的大部分,少量的神经细胞聚集在它们的周围(图版:H)。胸部的第2个神经节(TG2)已由中胸、后胸和腹部的前两个神经节合并形成,位于中胸与后胸之间(图版:I)。

　　3、结论和讨论

　　3.1不同昆虫种类神经节的结构和胚后发育比较

　　在低等的昆虫种类,如缨翅目、有翅亚纲较低等类群以及很多完全变态昆虫的幼虫期,其胸腹部可见到11对神经节,即胸部3对,腹部8对。一些进化的类群和很多完全变态类昆虫的成虫,胸、腹部的神经节常有不同程度的合并现象。在意大利蜜蜂的幼虫发育阶段,胸部和腹部的神经节没有愈合,共11对,每个神经节在幼虫早期各自独立,并且发育情况相似。但是到了蛹发育阶段,一些神经节逐渐发生愈合,到蛹发育的第5天以后,明显可见7对神经节,其中2对位于胸部,另外5对位于腹部。胸部第1个神经节(TG1)位于前胸,支配胸部第一对足的活动。第2个神经节(TG2)较大,由中胸、后胸和腹部的前两个神经节合并形成,位于中胸与后胸之间,该神经节发出的神经控制此区域的足、翅和肌肉等组织器官的活动。家蚕Bom-byx mori胸腹部神经节的愈合也发生在蛹期,在蛹发育早期,胸神经节TG1和TG2同腹神经节AG1和AG2融合,腹神经节AG6和AG7/8融合,到蛹发育的第4天以后融合完成。

　　在昆虫神经系统的发育过程中,细胞的增殖模式主要有2种:一是大型的成神经细胞通过不对称的细胞分裂方式增殖自己并产生小的神经节母细胞(GMCs);二是神经节母细胞通过循环的对称分裂产生神经细胞,这2种细胞增殖方式在意大利蜜蜂腹神经索的发育过程中都能看到。

　　BrdU标记显示,在意大利蜜蜂3龄幼虫每一个神经节的侧面和腹面靠近边缘的位置,都能看到大的成神经细胞,它们的直径在1.6±0.3μm。这些成神经细胞通过不对称的细胞分裂方式形成神经节母细胞,GMCs排列成串,朝向神经纤维网的方向。随后,GMCs经过对称分裂的方式快速增殖,并最终形成神经节中所有的神经细胞和神经胶质细胞。

　　这样的神经细胞增殖方式在中华蜜蜂脑部神经系统的胚后发育过程中也同样能够看到。就咽下神经节和胸神经节的组织结构和胚后发育特点来看,它们在幼虫发育阶段非常相似,几乎无法区分,但是胸神经节的增加比率明显快于咽下神经节。在幼虫发育早期时,咽下神经节所占的比例大于胸神经节,其成神经细胞的体积(直径约2.5±0.2μm)[9]

　　也明显大于胸神经节(直径约1.6±0.3μm)。但是在变态发育时,胸神经节的体积很快超过了咽下神经节,这可能是由于咽下神经节在幼虫早期就具有生理功能,所以它在孵化时比胸神经节更加成熟的缘故。

　　3.2蜜蜂腹神经索的神经胶质

　　Ito等通过对果蝇胚胎和幼虫早期腹神经索神经胶质细胞的类型和发育的观察,将其分为3大类6种类型:(1)表面神经胶质(surface-associated glia),包括亚神经鞘神经胶质(subperineurial glial cells,SPG)和通道神经胶质(channel glial cells,CG);(2)皮层神经胶质(cortex-associated glia),包括细胞体神经胶质(cellbody glial cells,CBG);(3)神经纤维网神经胶质(neuropile-associated glia),包括神经根神经胶质(nerveroot glial cells,NG),界面神经胶质(interface glial cells,IG)和中线神经胶质(midline glial cells,MG)。表面神经胶质、皮层神经胶质和神经纤维网神经胶质作为昆虫神经系统中神经胶质的3大类群,在许多昆虫中都存在,这已经得到证实,但是关于其下类群的分类方法,现在还存在争议。

　　对意大利蜜蜂腹神经索中神经胶质的形态和位置的观察表明,3种类型的神经胶质在意大利蜜蜂的腹神经索中都存在。在意大利蜜蜂3龄幼虫的腹神经节的边缘,能够看到亚神经鞘神经胶质(SPG),它们的细胞体呈四方形,胞核大而圆,细胞整齐地排列在神经节的周围;到蛹期,有些细胞变成扁平形。

　　SPGs的细胞质有时会延伸短的突起进入皮层,填充外围神经细胞体之间的空隙。SPGs与神经围膜一起构成昆虫中枢神经系统与周围体液之间的物质交换屏障。在果蝇幼虫的神经节中,SPGs的数量远少于蜜蜂,每个神经节中只有16个。

　　在蜜蜂3龄幼虫的腹神经索中,能够观察到皮层神经胶质中的细胞体神经胶质(CBG)。同果蝇类似,CBGs在皮层中的位置非常显著,它们的细胞核和细胞体非常不规则,细胞质延伸突起充满相邻的神经元细胞体之间的空隙。CBGs主要的作用是为神经元细胞体提供营养、支持以及空间约束。

　　在神经纤维网神经胶质的3种类型中,我们只观察到了界面神经胶质(IG),它们也被称为鞘状神经胶质(ensheathing glia)。界面神经胶质位于皮层和神经纤维网的分界面,其胞核是细长的椭圆体,IGs常发出突起包围神经纤维网。因为没有特殊的标记,所以在蜜蜂的腹神经索中通道神经胶质、神经根神经胶质(NG)和中线神经胶质(MG)无法辨识。

　　参考文献：
　　[1] 彩万志,庞雄飞,花保祯,梁广文,宋敦伦.普通昆虫学[M].北京:中国农业大学出版社,2001.