探讨钙结合蛋白S100A11在胚胎种植中的作用

　　S100A11 是钙结合蛋白 S100 家族的重要成员之一，在细胞内外发挥着多样生物学效应，如调节 Ca2 +稳态、调整细胞支架结构等。钙结合蛋白 S100A11 还可以作为细胞增殖调节器，通过其生物学效应调节肿瘤细胞增殖、侵袭及播散。

　　由于胚胎种植同肿瘤的发生与发展有类似的机制，且钙结合蛋白 S100A11 在人类胎盘绒毛膜组织和子宫内膜组织均中有表达，因此推测 S100A11 可能对胚胎种植有一定的调控作用。本研究通过免疫组化观察 S100A11 蛋白在子宫的分布，通过 Real － time PCR 和 Western Blot 方法分别监测S100A11mRNA 和蛋白在小鼠胚胎种植早期子宫中的表达，以期探讨钙结合蛋白 S100A11 在胚胎种植中的作用，为早期诊断胚胎种植障碍相关疾病和预测妊娠结局提供新的指标。现报道如下。
　　
　　1 实验资料

　　1. 1 实验动物
　　
　　雌性成年健康未孕 SPF 级昆明小鼠 30 只( 许可证号为 SCXK( 军) 2013 － 004) ，鼠龄 8 ～ 10 周，体质量35 ～ 40 g，连续观察 2 个动情周期。按雌∶ 雄比例 3∶ 1 合笼，检查到阴道栓确定为妊娠第 0 天。剖取子宫，漂洗后将子宫分为上中下 3 部分，一部分置于 4% 多聚甲醛溶液固定，切片。剩余放置在经 DEPC 处理的 EP 管中，－80 ℃保存，以备检测mRNA 和蛋白。

　　1. 2 主要试剂
　　
　　山羊抗鼠 S100A11 多克隆抗体( 博奥森) ;SP 免疫组织化学试剂盒( 中衫金桥) ; PCR 引物由北京鼎国公司合成。

　　1. 3 免疫组织化学( IHC)
　　
　　常规石蜡包埋，切片厚度 4 ～ 6μm，按照 PV 免疫组化试剂盒说明书要求，脱蜡、梯度乙醇浸泡，0． 3% H2O2封闭 10 min，PBS 清洗，热修复抗原，清洗，滴加 S100A11 多克隆抗体( 1∶ 300) ，4 ℃孵育过夜。PBS 清洗后滴加二抗 37 ℃孵育 45 min，PBS 清洗 3 ×5 min，DAB 显色、脱水、透明、封片。

　　1. 4 实时荧光定量( Real － time PCR)
　　
　　取 50 mg 的子宫组织，进行 S100A11mRNA 表达的检测。S100A11 上游引物 5＇－AGCGGGAAGGATGGAAAC － 3＇，下游引物 5＇ － GCTAAGCCAC-CAATGAGG － 3＇，扩增片长 191 bp; β － actin 为内参，其引物为上游 5＇－ CGTTGACATCCGTAACCTC －3＇，下游 5＇－ TAGGAGC-CAGGGCAGTAT － 3＇，扩增片长 89 bp。根据 Trizol 试剂盒说明匀浆并提取 RNA; 依照逆转录试盒说明书，取 RNA 溶液 5 μL在逆转录酶作用下成 cDNA; 然后以 cDNA 为模板进行实时定量总反应体系为 20 μL PCR，反应条件为 95 ℃ 15 s，62 ℃ 34s，72 ℃ 45 s，共 40 个循环，进行荧光检测。

　　1. 5 蛋白免疫印记( Western blot)
　　
　　取 50 mg 的子宫组织，进行 S100A11 蛋白表达的检测。将组织加入蛋白裂解液，匀浆后冰上裂解 0． 5 h，离心取上清。BCA 法蛋白定量，100 ℃ 变性 9 min 备用。制备15% SDS － PAGE 凝胶，加样后电泳至目的区域，转膜 7． 5 min，牛奶封闭 1 h，加入一抗 4 ℃ 过夜。

　　TBST 洗膜后加二抗，37 ℃ 孵育 1 h。之后加入显色剂，暗室胶片曝光、显影、定影，扫描胶片并且保存图片，分析条带光密度值，将目的条带与 β － actin 的光密度比值作为目的蛋白的相对表达量。

　　1. 6 统计学处理
　　
　　采用 SPSS 16． 0 统计软件进行分析处理。数据以均数 ± 标准差表示; 组间比较采用 F 检验，检验水准取 α =0． 05。

　　2 结 果

　　免疫组化结果发现，S100A11 蛋白主要分布在腺上皮和腔上皮中，而在间质细胞中表达呈弱阳性( 见图 1 ～6) 。表明S100A11 蛋白主要在子宫内膜细胞中表达。Real － time PCR提示，S100A11mRNA 在小鼠子宫内膜围着床期均有表达，其中妊娠第 4 天表达量明显升高，为妊娠前的近 120 倍( P ＜0. 01) ( 见图 7) 。Western blot 结果提示 S100A11 蛋白在围着床期子宫中均有表达，并在妊娠第 4 天、第 5 天明显升高，与妊娠前比较有显著性差异( P ＜0． 05) ，见图 8。【图略】

　　3 讨 论

　　“假恶性”的囊胚滋养层细胞与恶性肿瘤细胞在细胞增殖分化、侵袭信号转导通路、血管侵蚀和新生血管形成、免疫逃逸及细胞凋亡等诸多方面有相似性。目前也有研究显示多种肿瘤相关因子如 CD9、CD82 等在子宫内膜与胚胎中有规律性表达，提示它们可能参与了胚胎植入过程。

　　S100A11 是一种钙结合蛋白，调节细胞内钙动态平衡，转导钙依赖性的细胞调节信号，参与细胞的增殖、分化、细胞凋亡，在多种肿瘤组织中的活性都有改变，例如 S100A11 在乳腺癌、前列腺癌、NSCLC 表达上调，促进肿瘤侵袭与转移。

　　最近研究表明，S100A11 在胎盘绒毛膜组织中有分布。在早期妊娠流产患者中，其胎盘绒毛膜组织 S100A11 蛋白表达明显下调。S100A11 还在人类子宫内膜中有表达。在生殖障碍患者中，子宫内膜 S100A11 表达明显下降。

　　本研究通过免疫组化方法发现 S100A11 蛋白主要分布在子宫内膜，通过 Real － time PCR 和 Western blot 方法发现S100A11mRNA 和蛋白在小鼠子宫内膜种植窗期表达量明显上升。S100A11 的 表 达 增 多 与 胚 胎 植 入 的 同 步 性 提 示S100A11 可能是胚胎着床中的必需物质，且在胚胎着床过程中发挥重要作用。S100A11 作用的确切机制尚不清楚。刘欣梅研究发现，S100A11 靶向性 siRNA 处理后的子宫内膜细胞，滋养细胞球的黏附能力显著降低，推测 S100A11 可能通过调节子宫内膜细胞黏附相关的骨架重构及 β － catenin 和NFkB 信号通路活性，影响子宫内膜细胞的运动与侵袭，调节胚胎在子宫内膜上的黏附与侵入，进而影响子宫内膜容受性的形成与胚胎植入的结局。因此，S100A11 有望成为临床评价子宫内膜容受性和预测妊娠结局的标志性分子之一，可为早期诊断胚胎种植障碍相关疾病和预测妊娠结局提供新的指标。