酶放大DNA电化学传感器的进展综述

　　生物传感器系将生物敏感物质转换检测方便的信号的器件[1]，主要包括靶标识别元件和信号转换元件. 靶标识别元件是构建生物传感器的关键，必须对靶标有特异性与专一吸附或反应. 根据靶标识别元件的不同，生物传感器可分为酶传感器、免疫传感器、DNA 传感器等[2]. 信号转换元件是生物传感器的重要组成部分， 它对传感器的信号收集、运用、灵敏度等有极大的影响. 根据检测手段的不同，又分为质量敏感型、热敏型、场效应型、光学、电化学等传感器[3].

　　DNA 电化学生物传感器以 DNA 为靶标识别元件，以电化学方法为检测手段[4]，具有以下优点：

　　1）DNA 可人工合成，成本低，易于保存；2）对检测对象，不仅可根据碱基互补配对的原则，检测特定序列的 DNA，还可利用适配体的特点，检测离子、小分子、多肽、蛋白质甚至细胞；3）用量少，易微型化；4）可联用多种检测方式，如质量型、光学、电化学等. 其中电化学传感器由于选择性好、灵敏度高、成本低、操作简便和易于微型化等而备受关注[5].

　　酶是指具有生物催化功能的生物大分子，其催化效率很高， 对底物专一性好. 酶 DNA 电化学传感器响应快、操作简单，近年发展尤为迅速. 本文结合作者课题组的研究工作介绍酶放大 DNA电化学传感器的进展.

　　1 蛋白质酶 （ 聚合酶 、 连接酶 、 内切酶、外切酶）

　　脱氧核糖核酸 （DNA） 是生物遗传信息的载体， 其结构和功能对生物的遗传和变异有重要意义. 1953 年，Watson 和 Crick 提出了 DNA 的反向双螺旋结构，其两条 DNA 链对应的碱基 A-T 以双键形式连接，C-G 以三键形式连接， 糖-磷酸-糖主链在螺旋外侧， 配对碱基在螺旋内侧. 利用 DNA链之间碱基互补配对原则， 可实现特定序列的DNA 检测.

　　聚合酶、连接酶、内切酶、外切酶等蛋白质酶对 DNA 底物有较好的特异性和高效的催化. 利用酶与 DNA 的作用设计的 DNA 电化学传感器已展现出强大的优越性和研究活力[6]. 通过聚合酶反应的放大作用[7]，实现了目标物 （OTA）的超灵敏检测， 检测限达 6.5×10-11g·L-1. 利用 T4 连接酶将模板 DNA 首尾相接闭合成环并与引物 DNA 相结合，在 DNA 聚合酶的作用下，其引物可沿着环形模板不断扩增，达到滚环放大（RCA）形成多拷贝新链 DNA. 该 DNA 与通过 Au—S 键固定到金电极上的固定探针 DNA 杂交，从而可吸附更多电化学活性物质亚甲基蓝（MB）.

　　单一酶放大方法已可得到令人满意的检测效果， 通过有机耦合两种酶放大反应可得到更低的检测限. 鞠熀先课题组通过联用内切酶和聚合酶，实现了特定序列 DNA 的超灵敏检测（1.1×10-17mol·L-1）[8].

　　他们将生物素标记的捕获 cDNA 固定于亲和素修饰电极. 在目标 tDNA 存在下，与辅助 aDNA 及 cDNA碱基互补杂交，形成了内切酶活性位点，通过内切酶的作用使目标 tDNA 循环利用， 导致了大量的RCA 引物序列的暴露.又经 RCA 反应形成的长链DNA 与量子点标记的探针 DNA 杂交， 实现了对目标 tDNA 的灵敏检测. 通常， 聚合酶和内切酶对DNA 的活性位点只针对某一序列， 这给设计通用型 DNA 电化学传感器增添了难度，在一定程度限制了其运用[9]. 外切酶可从核酸一端开始按序列顺序催化水解核酸磷脂键，对 DNA 序列无特定要求[10-11]. 2010 年，Plaxco 小组率先提出了利用外切酶III（Exo III）实现目标物循环放大的检测方法[12]. 随后报道用 Exo III 酶在电极上反应的灵敏检测各种物质，如 DNA[13-15]、离子（Hg2+）[10]、蛋白质[16]等. 作者课题组报道了 Exo III 酶放大的免标记通用型检测tDNA 方法[11]. 如图 1 所示，将形成突出 3′端的双链 DNA 探针通过 Au—S 键固定于金电极上，当tDNA 与双链 DNA 探针杂交时就可得到 Exo III活性位点（钝的 3′端双链），释放出的 tDNA 又可进行下一轮剪切，最终使含游离鸟嘌呤碱基（G）的探针被大量剪切, 使其减弱对电化学活性物质亚甲基蓝（MB）的吸附，实现 tDNA 的灵敏检测. 此法利用游离的 G 和 MB 的强烈特异作用， 免去了对探针的修饰，提高了灵敏度且降低了检测成本.

　　2 酶联催化反应（辣根过氧化物酶）

　　聚合酶、内切酶、外切酶等显示出强大信号放大能力，其作用底物为 DNA，通常需对 DNA 进行电化学活性物质的标记 （如二茂铁和亚甲基蓝）.

　　在分析过程中， 通过构型改变导致电化学活性物质与电极距离变化， 从而其电信号改变就可检测目标物. 但这种构型变化引发的电化学信号较弱，其应用受限. 酶联免疫分析法利用抗体、抗原的特异性结合酶催化作用， 实现蛋白质分析检测[17-18].

　　该方法在核酸分析领域已引发关注[19-20].

　　辣根过氧化物酶（HRP）系常用的标记蛋白质或 DNA 酶， 可催化氧化 3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）形成蓝色氧化物，已广泛应用于比色传感领域[21]. 樊春海课题组[22]利用 HRP 具有催化氧化 TMB 的性能结合电化学的优势得到了 DNA的 fmol·L-1级别检测限. 他们将修饰 Biotin 和 Dig的分子信标（MB）固定于 Avidin 电极. 这种分子信标的结构阻碍了 Dig 与 Antidig-HRP 的结合. 当目标 tDNA 打开分子信标时，同时造成分子构型的改变， 促使暴露的 Dig 与 Antidig-HRP 结合， 得到HRP 氧化的 TMBOX的还原电流. 这种方法需分子信标修饰，增加了体系的复杂性和成本.作者课题组报道了用免标记的功能型分子信标检测特定序列的 tDNA[23]. 图 2 设计了含 SA 适配体序列的分子信标探针， 其位阻效应阻碍了适配体与 SA 的结合. 当目标物 tDNA 与探针相结合时，使适配体序列暴露于溶液中形成可与 SA-HRP紧密接触的结构，并测得 TMBOX还原电流，检测达到 pmol·L-1级别的 tDNA. 利用 SA 适配体与 SA的作用，可免去探针繁琐修饰，降低成本，取得优异的检测效果.

　　3 脱氧核酶（8-17 DNA 酶）

　　传统观点认为所有的酶均系蛋白质. 20 世纪80 年 代 初 ，Cech 和 Altman 发 现 了 核 酶 （Ri-bozyme）改变了这一看法[24], 随之人工合成筛选了有 RNA 切割和连接可催化形成肽键、磷酸化等能力的核酶. Breaker 小组也发现有同样催化能力的DNA 片段，即脱氧核酶 （DNA 酶 ）[25]. 这一重大的发现为核酸分析领域提供了重要思路， 许多 DNA酶的检测方法已有报道.

　　在 DNA 酶的催化反应， 常需金属离子作为辅酶因子. 因此，DNA 酶的生物传感器常用于金属离子的检测. 目前，已报道 Pb2+[26]、Hg2+[27]、Cu2+[28]、Mg2+[29]等作为辅酶因子的 DNA 酶. Pb2+作为 8-17 DNA酶的辅酶， 可激发酶的活性并能将一定结构的互1分析[30]. 在 Pb2+的存在下，8-17 DNA 酶活性被激发，切割其互补链，使修饰于 DNA 链两端的荧光基团和猝灭基团分离，实现了 Pb2+检测. Xiao 等[31]将 8-17 DNA 酶末端修饰电化学活性的亚甲基蓝并固定于电极上， 通过 Pb2+激发酶活性从而得到电流信号. 作者课题组报道了将 8-17 DNA 酶通过电化学发光（ECL）检测 Pb2+ [32]. 图 3 将氨基修饰的具有酶活性的 DNA 探针固定于活化羧基的玻碳基底， 加入功能核酸的底物 DNA 后， 在辅酶 Pb2+的作用下，8-17 DNA 酶将底物 DNA 切断， 使该8-17 DNA 酶通过碱基互补原则与修饰发光材料（Ru）的分子信标杂交，得到发光信号. 这种方法充分利用了 8-17 DNA 酶对底物 Pb2+的特异选择和碱基互补配对的原则, 实现了 Pb2+灵敏特异检测.

　　过氧化物酶活性的 DNA 酶在生物分析领域的运用越来越受重视[33-35]. 这类 DNA 酶对核酸序列的要求不高， 一般能形成 G-四分体结构的均能与血红素（Hemin）相作用构成 DNA 酶. G-四分体结构的 DNA 酶有类似于辣根过氧化物酶活性，在H2O2存在下可使鲁米诺（Luminol）催化发光[36]，也可 以 使 2,2′-连 氮-双 (3-乙 基 苯 并 噻 哩-6-磺 酸)（ABTS）[37-38]显色，已被广泛运用于比色传感器领域. Liu 等[13]将 G-四分体结构的 DNA 固定于电极，由于互补链 DNA 以其杂交屏蔽了其活性， 当目标在 tDNA 和 Exo III 的作用下，使其恢复催化活性，体现双酶的优势，实现 tDNA fmol·L-1级别的检测.

　　4 DNA 电化学生物传感器的常见问题与解决方案

　　国内外研究者一直致力于发展 DNA 电化学生物传感器，结合酶放大方法实现超灵敏、特异的目标物检测，已取得了很好的进展. 目前该方法存在的主要问题：1）电极选择：主要有玻碳电极和金电极. 玻碳电极需要较为复杂的预处理， 固定探针时其露出的羧基与修饰了氨基的探针需经较长时间的孵化[32]. 金电极主要是通过自组装，利用 Au—S键将探针固定于金电极上[11, 23]；2）固定探针的浓度：

　　不同的体系， 固定于电极上的探针浓度会极大地影响分析效果，浓度过高造成较大的排斥，降低其与目标物的接触效率，浓度太低则信号较弱. 目前主要根据不同体系经优化选取最佳的信噪比[10, 39]；3）非特异性吸附：固定探针的同时需防止探针的非特异性吸附， 常用巯基己醇或氨基己醇. 在酶反应的过程中，金电极与酶吸附所造成的背景信号极大地影响其分析效果，通常可用 BSA 封闭金电极[23]；4）杂交效率：非均相反应会不同程度地影响分析效果. Wang 课题组提出了三元单层结构组成的电化学传感界面，其中巯基己醇（MCH）使固定于电极表面 DNA 探针可直立于电极表面从而得到统一的构型，有利于杂交. 二硫苏糖醇（DTT）通过两个巯基固定于电极上， 其两个亲水羟基使 DNA 杂交传感器的杂交效率更高，分析效果更好[40-41].

　　5 DNA 电化学传感器的发展趋势

　　比表面积和导电效果均是影响电化学传感器分析效果的重要因素. 碳纳米管、石墨烯、金属纳米粒子等的修饰，结合 DNA 的识别作用越来越受到关注[42-43]. 纳米磁珠的富集能极大地提高信号 ，已被广泛报道[5]. 免标记的电化学方法简单、快速、方便，已受到极大的重视, 特异性好、灵敏度高的免标记 DNA 电化学生物传感器是今后的研究方向. 对此，作者在研究免标记 ATP 检测方面进行了一些尝试[44]，研究结果进一步证明了免标记电化学检测的特点和应用潜力. 然而，DNA 电化学生物传感器常需将识别探针固定于电极上， 这种非均相反应使分析体系受到一定限制， 如固定探针过程繁琐、杂交效率低与非特异性吸附. 发展均相反应的 DNA 电化学传感器正日益受到重视.