氧化锌纳米颗粒对Luminol-EDTA-ZnONPs体系化学发光的影响

　　1 引 言

　　咖啡酸（ Caffeic acid） ,化学名为 3-（ 3,4-二羟苯基） -2-丙烯酸或 3,4-二羟基肉桂酸，属于酚酸类化合物，广泛存在于许多植物中，如菊科植物，蔷薇科植物以及食物中[1].咖啡酸具有抗炎和免疫调节作用[2,3].此外，咖啡酸无论是在体内还是体外均具有抗氧化能力，能够清除自由基和抑制脂质过氧化[4].现已报道的咖啡酸含量测定方法主要有高效液相色谱[5]、咖啡酸印迹石英晶体微纳米传感器[6]、电化学[7]、高效薄层色谱[8]和化学发光等[9].

　　氧化锌纳米颗粒（ ZnO NPs） 是一种重要的半导体纳米材料，广泛应用于光催化、光学和电子学等领域[10 ~12].许多文献报道了将 ZnO NPs 应用于化学发光中，如 Li 等[13]研究发现，ZnO NPs 能增强鲁米诺（ Luminol） -H2O2化学发光。Biparva 等[14]将 Luminol-H2O2-ZnO NPs 体系应用于测定制药配方中的卡维地洛，取得较好的结果。在报道中，ZnO NPs 催化 H2O2分解，增强 Luminol 化学发光。但是 H2O2本身就是一种强氧化剂，能直接与 Luminol 发生反应，且易分解，使得实验背景值大和发光信号不稳定。

　　研究发现，在 ZnO NPs 和 EDTA 存在的条件下，无需 H2O2等氧化剂的参与，Luminol 也能产生很强的化学发光，从而建立了一种新的化学发光体系 Luminol-EDTA-ZnO NPs.EDTA 是一种二钠盐，具有很好的稳定性，使化学发光信号稳定。EDTA 自身不具有氧化性，不能氧化 Luminol 化学发光，体系背景值低。本实验中基于咖啡酸能够有效抑制 Luminol-EDTA-ZnO NPs 化学发光，建立了流动注射化学发光法测定药片中咖啡酸的含量。本方法具有简单、快速、线性范围宽和灵敏度高等特点。通常情况下，化学发光体系中的纳米颗粒催化活性与它们的粒径大小[13]、表面状态[15]、形貌[16]等有关，因此本研究考察了不同粒径的 ZnO NPs 对 Luminol-EDTA-ZnO NPs 体系化学发光的影响。

　　2 实验部分

　　2. 1 仪器与试剂

　　IFFM-E 型流动注射化学发光分析仪（ 西安瑞迈分析仪器有限公司） ; UV-2450 紫外-可见分光光度计、电子天平（ 日本 SHIMADZU 公司） ; 数显恒温磁力搅拌器（ 金坛市双捷实验仪器厂） ; GL-16A 高速冷冻离心机（ 上海菲洽尔分析仪器有限公司） ; KQ-100B 型超声波清洗器（ 昆山市超声仪器有限公司） ;DELTA320 pH 计（ 梅特勒-托利多仪器有限公司） ; 艾柯 DZG-303A 纯水制备仪（ 成都唐氏康宁科技发展有限公司） ; ZEISS Libra200 透射电镜（ 德国 ZEISS 公司） .鲁米诺（ Aladdin 公司） ; 甲醇 （ 分析纯，重庆川东化工有限公司） ; EDTA、Na2CO3、NaHCO3、无水乙醇、Zn（ Ac）2·2H2O 和 NaOH（ 分析纯，成都市科龙化工试剂厂） ; 实验用水为去离子水。

　　2. 2 标准溶液的配制

　　准确称取 0. 4429 g 鲁米诺，用 0. 1 mol/L NaOH 溶液溶解并定容至 250 mL 棕色容量瓶中，配制成10 mmol / L 鲁米诺储备液，在 4℃ 下避光保存，放置 7 天后使用。根据需要，用 0. 1 mol / L Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液（ pH 10. 40） 稀释成所需浓度，即配即用。

　　2. 3 ZnO NPs 的制备

　　参照文献方法并略有改动，制备了不同粒径的 ZnO NPs.

　　方法一[17],称取 3. 2927 g Zn（ Ac）2·2H2O （ 0. 03 mol） ,溶于 100 mL 甲醇溶液。在室温常压下，超声 10 min,得到澄清透明的溶液。将溶液转移到圆底烧瓶中，在反应温度 60℃下冷凝回流，用磁力搅拌器不断搅拌，反应24 h,反应结束后冷却到室温。1300 r/min 离心分离 10 min.先用甲醇洗涤除去副产物，再用水洗涤甲醇，得到单相 ZnO NPs.重复实验，制备一定量的 ZnO NPs,得到第 1 种 ZnO NPs.

　　方法二[18]: 取等量 100 mL Zn2 +溶液和 NaOH 溶液，分别加入 150 mL 含有分散剂的水中，反应温度为 20℃，加入的速度控制在 0. 28 ~1. 1 mL/min,并且不断搅拌。待加入反应试剂后，用蒸馏水洗涤白色沉淀，分散。通过改变滴加的速度，得到第 2 种和第 3 种 ZnO NPs.

　　方法三[19] : 分别配制 0. 1 mol/L Zn（ Ac）2·2H2O 和 0. 2 mol / L NaOH-乙醇溶液 50 mL,水浴溶解待用。将溶解完全的 NaOH-乙醇溶液放入 0℃冰水中降温至同等温度，然后在 0℃下磁力搅拌，缓慢滴加同体积的乙酸锌醇溶液中，形成透明氧化锌溶胶。滴加完毕，继续在 20℃下保温反应 0. 5 h,取出，加入适量的蒸馏水提纯溶胶，溶胶沉淀出絮状氧化锌，室温下离心分离后，洗涤数次，室温下干燥得到纳米氧化锌粉体，得到第 4 种 ZnO NPs.

　　2. 4 化学发光的测定

　　采用图 1 所示流路研究 Luminol-EDTA-ZnO NPs 体系的化学发光，并测定咖啡酸片中咖啡酸的含量。实验条件： 0. 20 mmol/L EDTA,0. 2 mmol/L Luminol,pH 10. 20,0. 20 g/L ZnO NPs.

　　3 结果与讨论

　　3. 1 ZnO NPs 的表征

　　通过 3 种制备方法得到了 4 种不同的 ZnO NPs,电镜图（ 图 2） 显示，4 种 ZnO NPs 形状均为球形，第 1 ~ 第 4 种 ZnO NPs 粒径分别约为 36,80,120 和10 nm,对 4 种 ZnO NPs 进行了紫外吸收光谱测定，其结果如图 3 所示。第 1,第 2 和第 4 种 ZnO NPs 的最大吸收峰都在 360 nm 处，而第 3 种 ZnO NPs 没有出现紫外吸收峰。单分散纳米颗粒的吸收峰的半宽峰较窄，多分散纳米颗粒则会在长波长方向出现吸收峰拖尾，由此可以说明，第 1 和第 2 种 ZnO NPs 在水中的分散性比第 3 和 4 种 ZnO NPs 更好。

　　3. 2 不同 ZnO NPs 对化学发光的影响

　　不同的 ZnO NPs 对化学发光的影响结果见图 4.对于第1、第2 和第3 种 ZnO NPs,随着 ZnO NPs 粒径增大，ZnO NPs 对化学发光的增强作用逐渐减弱，可能的原因是 ZnO NPs 的粒径对 ZnO NPs 的增强作用有一定影响，粒径较小的 ZnO NPs 对化学发光的催化作用更强。第 4 种 ZnO NPs 粒径约为 10 nm,是 4 种 ZnO NPs 中粒径最小的，它对化学发光的增强作用最弱，可能的原因是第4 种 ZnO NPs 在水中的分散性不好，容易发生聚集，不能形成均一的分散体系，降低了 ZnO NPs 的催化活性面，从而降低了 ZnO NPs 的催化活性。实验结果表明，ZnO NPs 粒径和分散性均会影响其催化活性，粒径越小，分散性越好，催化活性越强。

　　3. 3 实验条件的选择

　　在咖啡酸存在的条件下，考察了各反应条件对相对发光强度 ΔI（ 加入咖啡酸后的化学发光强度为I,空白的化学发光强度为 I0,ΔI = I0- I） 的影响，其结果见图 5.图 5A 显示了 ZnO NPs 质量浓度对 ΔI的影响，ZnO NPs 质量浓度范围在 0. 025 ~0. 20 g/L 时，ΔI 随着 ZnO NPs 浓度增大而增加，在 ZnO NPs质量浓度到达 0. 20 g/L 时，ΔI 达到最大； 当 ZnO NPs 质量浓度大于 0. 20 g/L 时，ΔI 随着 ZnO NPs 质量浓度的增大而变小。Luminol 浓度对 ΔI 的影响见图 5B,Luminol 浓度范围在 0. 04 ~0. 20 mmol/L 时，ΔI随着 Luminol 浓度增加而迅速增大，Luminol 浓度大于 0. 20 mmol/L 时，ΔI 随着浓度的增大而增加得比较缓慢。pH 值对 ΔI 的影响如图 5C 所示，pH 在 9. 20 ~ 10. 20 范围时，ΔI 随着 pH 值的增加而不断增大，当 pH =10. 20,ΔI 变化不大，趋于平稳。EDTA 浓度对 ΔI 的影响如图 5D 所示，ΔI 随 EDTA 浓度的增大而增加。当 EDTA 的浓度达到 0. 20 mmol/L 时，ΔI 的值达到最大，并保持基本不变。因此，Lumi-nol-EDTA-ZnO NPs 发光体系各物质的合适浓度为： 0. 20 mmol / L EDTA,0. 20 mmol / L Luminol,pH 10.20,0. 20 g / L ZnO NPs.

　　3. 4 咖啡酸的测定

　　3. 4. 1 线性范围、检出限和重现性 在优化的条件下测定咖啡酸片中咖啡酸的含量。咖啡酸浓度的对数（ lgc） 和相对发光强度 ΔI 分段呈良好的线性关系，咖啡酸浓度在 1. 0 ×10!7~ 1. 0 × 10!6mol / L 范围内，其线性回归方程为 ΔI = 158. 2lgc + 12417. 9（ r = 0. 9987） ; 咖啡酸浓度在 1. 0 × 10!6~ 1. 0 ×10!5mol / L 范围内，其线性回归方程为 ΔI = 259. 5lgc + 4405. 2（ r = 0. 9970） .根据 IUPAC（ 3σ） 规定，计算得方法的检出限（ LOD） 为 1. 8 × 10!8mol / L.平行测定浓度为 4. 0 × 10!7mol / L 的咖啡酸标准溶液11 次，其 RSD 为 3. 5% .与其它采用测定咖啡酸的文献相比（ 表 1） ,本方法能够获得较低的检出限和较宽的线性范围，并且使用 Luminol-EDTA-ZnO NPs 流动注射化学发光的方法具有简单、快捷、稳定、重现性好等特点。

　　3. 4. 2 干扰实验 在选定的实验条件下，考察了多种物质对 4. 0 × 10!7mol / L 咖啡酸发光强度的影响，当以相对误差为 ±5% 作为干扰水平上限时，其结果表明： 1000 倍的 Na+,K+,Cl!; 800 倍的 HCO2!3,SO2!4,CO2!3,Ca2 +; 500 倍的乙醇、淀粉、葡萄糖； 400 倍的柠檬酸、环糊精均不干扰测定。

　　3. 4. 3 样品测定 取市售的咖啡酸片剂5片（ 标示量： 0. 1g / 片） ,准确称量，研细均匀。取0 . 0250 g咖啡酸粉末，以水溶解并定容至 100 mL,以此为待测样品，采用标准加入法进行回收率测定，回收率在 97% ~101%之间（ 表 2） .测得咖啡酸片剂中咖啡酸含量为 0. 0998 ±0. 0021 g/片，与标示量一致。

　　研究结果表明，Luminol-EDTA-ZnO NPs 法具有简单、快捷、稳定、重现性好等特点。