核糖体RNA合成中SUMO化修饰Apak的功能(2)

　　制备蛋白样品，  10%的聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，  90  m A恒定电流将蛋白电转至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene  fluoride,  PVDF）上，  5%的脱脂牛奶封闭1  h后 按 一 定 比 例 稀 释 一 抗 孵 育4℃ 过 夜，TBST（tris  buffer  solution-Tween）缓冲液洗涤3次，二抗室温孵育1  h,  TBST洗涤3次，用化学发光试剂（enhanced  chemiluminescent,  ECL）曝光胶片，然后进行显影和定影。
　　
　　2结果
　　
　　2.1   SUMO化修饰的Apak抑制核糖体RNA的合成
　　
　　前期的研究发现，  ARF促进Apak移位于核仁并发生SUMO化修饰，本实验室首先模拟SUMO化修饰的Apak构建了Myc-SUMO-Apak融合表达质粒，研究表明，  Myc-SUMO-Apak融合表达质粒降低对p53的转录活性的抑制，进一步发现该融合表达质粒改变了Apak的核质定位移位于核仁[11].核仁是核糖体RNA合成的场所，那么SUMO化修饰的Apak是否 会 对 核 糖 体RNA的 合 成 有 影 响？首 先 通 过Northern  blot检测Myc-SUMO-Apak融合蛋白对47Spre-r RNA合成的影响，而成熟的18S,  28S及5.8Sr RNA均由47S pre-r RNA剪切加工形成（图1A）[8],发现47S  pre-r RNA的合成量明显降低，同时32S,  18S,28S  r RNA的量也相应减少（图1B）。  18S:47S和28S:47S  r RNA比率分别降低18%和22%（图1C），说明SUMO化修饰的Apak抑制核糖体RNA的合成。2.2   SUMO化修饰的Apak抑制RNA聚合酶Ⅰ介导转录的18S和5.8S r RNA
　　
　　运用实时定量PCR进一步检测SUMO化修饰的Apak对核糖体RNA转录的调控。过表达外源的Myc-SUMO-Apak质粒，检测RNA聚合酶Ⅰ转录的18S和5.8S  r RNA,  RNA聚合酶Ⅲ转录的5S  r RNA,t RNATyr以及RNA聚合酶Ⅱ转录的核仁素、ARPPP0.结果表明，过表达外源的Myc-SUMO-Apak后18S和5.8S r RNA的水平分别降低20%和35%,但是5S  r RNA,  t RNATyr以及核仁素、ARPP  P0的水平没有明显变化（图2），说明SUMO化修饰的Apak主要抑制RNA聚合酶Ⅰ介导转录的18S和5.8S r RNA.
　　
　　2.3放线菌素D诱导促进Apak与18S, 5.8S r RNA相互作用
　　
　　低浓度5  nmol/L的放线菌素D（Act-D）主要抑制RNA聚合酶Ⅰ的活性从而抑制核糖体的合成，研究发现，在Act-D诱导条件下， Apak发生SUMO化修饰并移位至核仁，同时Apak的稳定性增加，且这一过程依赖于ARF[11].已知SUMO化修饰的Apak抑制47S  pre-r RNA的合成，在Act-D诱导下Apak是否与核糖体RNA存在相互作用，从而抑制核糖体的合成？在H1299细胞中，通过RNA染色质免疫共沉淀（RNAchromatin  immunoprecipitation,  RNA-Ch IP）实验检测内源Apak与18S, 5.8S r RNA的相互作用，在非应激情况下，  Apak抗体和对照的Ig G进行免疫共沉淀（immunoprecipitation, IP），在IP产物里没有检测到内源Apak与18S, 5.8S r RNA的相互作用； 5 nmol/L的Act-D处理24 h后，在Apak抗体IP的产物中检测到18S,  5.8S  r RNA,对照的Ig G样品中没有检测到（图3A），说明当Act-D诱导Apak发生SUMO化修饰后，促进Apak和18S, 5.8S r RNA的结合。 Act-D分别诱导处理0, 4, 8, 16, 24 h,Act-D处理8 h后， Apak与18S,5.8S r RNA结合逐渐增强（图3B）。
　　
　　2.4癌基因激活促进Apak与18S, 5.8S r RNA相互作用
　　
　　癌基因作为一种非常重要的应激，在其激活下Apak与p53解离，解除对p53转录活性的调控，这一过程依赖于ARF[10].癌基因能够稳定Apak的蛋白水平，且促进SUMO修饰，同时也依赖于ARF[11].因此检测癌基因激活下，  Apak与18S,  5.8S  r RNA相互作用，在H1299细胞中外转Myc-Ras V12,  Ch IP实验显示， Apak与18S, 5.8S r RNA存在相互作用（图4A）。另外转染Myc-Ras V12的同时敲低内源ARF的表达后，Apak与18S,  5.8S  r RNA的相互作用消失（图4B），说明癌基因激活促进Apak与18S, 5.8S r RNA相互作用并且依赖ARF.
　　
　　3讨论
　　
　　核仁是核糖体RNA的合成以及核糖体形成的重要场所，超过1/3的核仁蛋白都在核糖体RNA的转录或转录后加工过程发挥作用[12].研究表明，核仁能响应多种细胞应激，核仁应激对核糖体的调控是近期研究的热点。本研究发现， SUMO化修饰的Apak 抑制核糖体RNA的合成，在放线菌素D和癌基因诱导条件下可以促进Apak与18S, 5.8S r RNA发生相互作用。
　　
　　SUMO化修饰对核蛋白在核仁和核质的分布发挥重要的调控作用，同时SUMO化修饰的核蛋白移位于核仁可能对核糖体RNA合成及加工有重要影响。研究报道SUMO化修饰的NPM1可以抑制32S r RNA的加工[8].在核仁应激下抑癌蛋白ARF促进Apak的SUMO化修饰并移位至核仁，  SUMO化修饰的Apak可能在核糖体RNA的合成或加工过程发挥重要作用，本研究发现SUMO化修饰的Apak可以抑制核糖体RNA的合成。核糖体内RNA的合成、加工及组装是多步骤过程， SUMO化修饰的Apak对核糖体RNA转录后加工及组装的影响还有待进一步研究。
　　
　　ARF响应多种细胞应激信号，癌基因的激活下ARF与p53竞争性结合Apak抑制了Apak对p53的负调控作用[10].核仁应激及癌基因激活上调ARF蛋白表达并快速抑制核糖体RNA的转录效率[13].同时本研究表明， ARF促进Apak的SUMO化修饰由核质移位于核仁并抑制核糖体RNA的合成，因此ARF与Apak可能协同响应细胞应激，从而抑制核糖体RNA的合成。有报道ARF可以通过与5.8S  r RNA结合抑制32S r RNA的剪切[14].在哺乳动物中KRAB型锌指蛋白作为最大的转录调控因子家族对RNA的剪切加工有调控作用[15].本研究发现，在核仁应激及癌基因激活条件下，促进Apak与18S,  5.8S  r RNA结合，且依赖于ARF.因此Apak可能协同抑癌蛋白ARF共同靶向18S,  5.8S  r RNA,从而抑制核糖体RNA的加工过程。
　　
　　本研究发现，在核仁应激或癌基因激活条件下， SUMO化修饰的Apak入核仁后发挥抑制核糖体形成的新功能。在人类肿瘤中Apak是否作为抑癌因子抑制核糖体的合成从而抑制肿瘤细胞的恶性增殖？  Apak的表达水平是否对肿瘤的发生发展有抑制作用？这一系列问题还有待进一步研究。基于对Apak功能的研究，有可能为临床肿瘤的检测提供新的标志物。
　　
　　参考文献：
　　
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