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大肠杆菌中鸡SP-A蛋白的表达及其生物学活性

来源:学术堂 作者:朱老师
发布于:2017-04-12 共5492字
  摘要

        鸡肺表面活性蛋白A(chicken pulmonarysur-factant protein A,cSP-A)是Ⅱ型肺泡上皮细胞分泌的一种亲水性糖蛋白,属于C型凝集素家族中的一种[1].C型凝集素的共同特征在于:氨基(N)末端含有胶原样结构域(collagen-like region,CLR)、羧基(C)端含有碳水化合物识别结构域,可与病原体和过敏原 结 合[2].cSP-A基 因 位 于 鸡6号 染 色 体上,编码区全长669bp,含222个氨基酸残基(aa),分为5个结构域:N端区、CLR、未知区、茎区(neckdomain)和凝集素糖识别区(carbohydrate recogni-tion domain,CRD)[3].近年来,对SP-A蛋 白的免疫学功能的研究越来越深入,哺乳动物源SP-A已被证实可结合多种病原体,增强肺泡巨噬细胞的趋化作用和吞噬功能,诱导免疫细胞增殖,并刺激促炎细胞因子的产生[4].
  
  虽然不同动物源的SP-A在功能上高度相似,但通过氨基酸序列比对却发现:cSP-A与哺乳动物源SP-A的同源性仅有40%左右[5],cSP-A在鸡体内的组织分布和临床作用是否与哺乳动物源的SP-A一致尚不得而知[1],而且,从鸡肺泡灌洗液获取天然cSP-A蛋白的步骤较为繁琐,费用昂贵,阻碍了cSP-A的临床研究和应用。
  
  本实验室的前期工作已经对cSP-A的N末端和CRD分别进行了原核表达和多克隆抗体制备[6],但没有涉及cSP-A全长基因的研究。本研究将 选择pCold-TF载体进行cSP-A全基因的载体构建,以期在大肠杆菌中实现高效可溶性表达,并对纯化产物进行生物学活性检测,为进一步研究cSP-A的功能和临床作用奠定基础。
  
  1材料与方法
  
  1.1实验动物与试剂
  
  60日龄健康三黄鸡1只购自安徽省某 鸡 场。pMD19-T Simple、pCold-TF原核表 达 载 体 均 购 自宝生物工程(大连)有限公司。大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)感 受 态、TRIzol试 剂 均 购 自 美 国In-vitrogen公司。反转录试剂盒购自普洛麦格生物技术有限 公 司。Phanta Max Super-FidelityDNA聚合酶购自南京诺唯赞生物公司。T4DNA连接酶、限制性内切酶NdeⅠ和SalⅠ均购自英国NEB公司。DL2000DNA ladder、凝胶回收试剂盒均购 自德国Qiagen公司。质粒小量提取纯化试剂盒购自美国Axygen公司。His·Tag融合蛋白纯化试剂盒购自德国Merck公司。10~250ku预染小分子质量蛋白质Marker购 自 美 国 热 电 公 司。HRP标记的山羊抗小鼠IgG购自美国Sigma公司。ECL显色发光试剂盒购自美国Piece公司。cSP-A的凝集素糖识别区多克隆抗体由本实验室制备[6].纯化的天然cSP-A蛋白由本实验室制备[6-7].
  
  1.2 RT-PCR
  
  取健康鸡肺组织100mg,加入TRIzol试剂提取组织mRNA,-80 ℃保存备用。参照GenBank中cSP-A登录的全长序列(AF411083)设计了1对引物,上游 引 物:CCCAAGCAACCATGTTGTCT-TATT,下 游 引 物:CTAATATTCACAGACTGT-GAGGCGG.利用Oligo d(T)18引 物 对 鸡 肺 组 织mRNA进 行 反 转 录 并 获 得 其cDNA,然 后 进 行PCR,扩增程序:95℃ 5min;94℃ 30s,60℃ 50s,72℃ 1min,共30个循环;72℃ 10min;维持在10℃。PCR产 物 进 行 电 泳 鉴 定,回 收 目 的 条 带,与pMD19-T Simple载 体 连 接,连 接 产 物 转 化DH5α感受态细胞,涂布含100μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB平板,过夜培养,挑取阳性菌落进行PCR鉴定,并送苏州金唯智生物科技有限公司测序。
  
  1.3 cSP-A成熟肽基因的PCR扩增
  
  在获得cSP-A全长序列的基础之上,设计1对引物 用 于 扩 增cSP-A成 熟 肽 全 长,上 游 引 物 为cSPA-55F:ATTCATATGCCATGCACAGAAC(下划线处为NdeⅠ酶切位点),下游引物为cSPA-R:ATAGTCGACCTAATATTCACAG(下 划 线 处 为SalⅠ酶切位点)。PCR反应条件:94 ℃ 2min;94℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 1min,30个循环;72℃ 10min;10 ℃维持。PCR产物进行电泳 鉴定,回收目的条带,-20℃储存备用。
  
  1.4重组表达载体的构建
  
  利用限制性内切酶NdeⅠ+SalⅠ分别对目的基因的PCR产物和pCold-TF表达载体质粒DNA进行双酶切,将纯化回收的PCR产物与相应酶切的表达载体连接,转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。PCR筛选阳性克隆,提取质粒DNA,送苏州金唯智生物科技有限公司测序。
  
  1.5重组蛋白的诱导表达、纯化
  
  将pCold-TF与pCold-cSPA均 转 化 到BL21(DE3)感受态细胞中,37℃培养过夜。取少量利用不同浓度的IPTG进行诱导表达,16℃诱导24h后收集菌液,超声波裂解,5000r/min离心10min,分别收取裂解上清和包涵体沉淀。利用His·Tag融合蛋白纯化试剂盒纯化。分别取上述少量蛋白质样品,加入 等体积2×上样缓 冲液,95 ℃加 热处 理5min,同时将pCold-TF空载体菌诱导产物作为阴性对照。12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析融合蛋白的表达情况。
  
  1.6免疫印迹
  
  分别取0.1、0.5和1μg的cSP-A纯化产物,加入等量的2×上样缓冲液,95℃加热处理5min后,经SDS-PAGE分离,利用垂直转印仪,将胶上蛋白质转移至硝酸纤 维素膜(NC)上,经考马斯 亮蓝染色,将NC膜转移到50g/L脱脂奶粉溶液中4℃封闭过夜。弃封闭液,TBST洗 涤后,加1∶1 000稀释的cSPA-CRD小鼠多克隆抗体,室温下反应2h,TBST洗涤3~5次,二抗为1∶5 000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG,室温作用1h,TBST洗涤3~5次,用化学发光试剂盒(ECL)进行显色,在天能发光成像系统中成像分析。
  
  1.7鸡肺灌洗液的制备及天然SP-A蛋白的制备与纯化
  
  选取1.5kg左右的健康三黄鸡,按150mg/kg体质量注射戊巴比妥进行麻醉,对鸡颈部皮肤进行剥离,用手术刀做1cm纵切口,将连有医用三通阀的灌洗装置插入鸡气管内,一次性注入15mL灭菌PBS溶液,反复灌洗,收集洗液,经1 000r/min离心10min,收集上清即为肺部灌洗液。采用Maltose-agarose亲和层析法[7]提取并纯化鸡肺灌洗液中的SP-A蛋白。
  
  1.8抑菌活性检测
  
  采用单层琼脂平板扩散法进行检测,以纯化的天然cSP-A蛋白作为对照。分别取巴氏杆菌、大肠杆 菌(CMCC44102)、甲 型 副 伤 寒 沙 门 菌(ATCC9150)、金 黄 色 葡 萄 球 菌(ATCC25923)、粪肠球菌(CMCC29212)于LB培养基平板划线,37℃过夜培养。活化后的指示菌按1∶100滴加到40℃左右灭活的LB培养液中,振荡混匀,倒入灭菌的平板中,冷却凝固后,用内径7mm的打孔器分别在各指示菌平板上均匀打孔,依次加入1μg纯化的天然cSP-A蛋白、1μgpCold-cSPA原核表达纯化蛋白、1μgpCold-cSPA诱导表达产物、50μL无菌水(阴性对照)、50μL卡那霉素(100μg/mL)(阳性对照)。
  
  2结果
  
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