N-酰基高丝氨酸内酯 （N-acylhomoserine lactone,AHL） 是革兰氏阴性细菌群体感应系统中最关键的一类信号分子，可调控相关致病基因的表达，引起动植物病害[1].当病原菌释放到环境中的AHL浓度达到一定阈值时能够诱导致病菌毒力基因的表达，造成动植物病害[2 - 5].苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt） 中的aii A基因 （auto inducer inactivation A,aii A） 编码的Aii A蛋白是一种N-酰基高丝氨酸内酯酶 （AHLase） ,能水解AHL信号分子的内酯键破坏其构象，减少AHL的积累，抑制致病菌毒力基因的表达，从而实现对相关植物病害的防治，有望成为农业生产上一种生物农药[6 - 7].利用基因工程菌高表达AHL内酯酶将成为防治革兰氏阴性病原菌的重要手段[8 - 10].
当前研究人员已在多个不同的表达系统中实现了Aii A蛋白的表达，如大肠杆菌 （Escherichia co-li）[11 - 12]、枯草芽胞杆菌 （Bacillus subtilis）[13]以及毕赤酵母 （Pichia pastoris） 等表达系统[9,14].但前期研究发现，在大肠杆菌表达系统中Aii A蛋白大多以包涵体形式存在，需要进行繁琐的变复性才可获得具有较高生物活性的Aii A蛋白[15]; 枯草芽胞杆菌表达的Aii A蛋白易被宿主自身分泌的蛋白酶降解； 毕赤酵母表达系统能够实现蛋白的分泌表达，具有高的遗传稳定性、较快的繁殖速度、表达产物易于大规模分离纯化等特点，弥补了大肠杆菌和枯草芽胞杆菌表达系统的缺点，使其在原核基因和真核基因的异源表达中具有很大优势[16].但是前期研究也发现毕赤酵母表达系统存在蛋白表达水平不如枯草芽胞杆菌或者大肠杆菌等原核宿主的缺点[14].本研究基于前期对aii A基因的密码子偏好性分析[17],根据毕赤酵母基因组密码子用法及可能影响毕赤酵母转录效率的因素对aii A基因进行全序列同义设计[18 - 20],利用优化后的aii A基因 （Oaii A） 构建多拷贝重组毕赤酵母，以期提高毕赤酵母表达Aii A蛋白的水平。
1材料和方法
1. 1材料
1. 1. 1质粒与菌株
载体p PICZαB和GS115购自Invitrogen公司；E. coli DH5α感受态细胞由本实验室保存； 胡萝卜软腐欧文氏杆菌 （Erwinia carotovora） 由福建省农业科学院邱思鑫研究员馈赠。
1. 1. 2主要试剂
T4 DNA连接酶、所有限制性内切酶均购自Promega公司； 碱性磷酸酶CIAP（alkaline phospha-tase,calf intestinal）、DNA Maker均购自Ta KaRa公司；Zeocin抗生素购自上海英骏生物技术有限公司；San Prep柱式DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。兔源抗组氨酸标签抗体 （ 一抗A,识别融合蛋白组氨酸标签部分）、聚偏二氟乙烯 （polyvinylidene fluoride,PVDF） 膜、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠Ig G（H + L） 购自北京鼎国生物技术有限公司； 鼠源抗Aii A特异性抗体（ 一抗B,识别融合蛋白Aii A部分） 由本实验室制备。
1. 1. 3培养基
①LLB（low salt luria-bertani） 培养基 （1 L） : 酵母提取物5. 0 g,胰蛋白胨10. 0 g,Na Cl 5. 0 g,调p H至7. 5,高压灭菌。配制固体培养基时，在灭菌前加入体积分数为2%的琼脂。 ②酵母浸出粉胨葡萄糖培养基 （yeast extract peptone dextrose medium,YPD） （1 L） : 将10. 0 g酵母提取物，20. 0 g蛋白胨，20. 0 g无水葡萄糖溶解于1 L水中，115 °C灭菌15 min.配制固体YPD培养基时，在灭菌前加入体积分数2%的琼脂。 ③其余培养基： 缓冲复合甲醇培养基 （buffered methanol-complex medium,BMMY） ,缓冲复合甘油培养基 （buffered glycerol-complex medium,BMGY） ,最小甲醇培养基 （mini-mal methanol,MM） , 最小葡萄糖培养基 （minimal dextrose medium,MD） 等均参照Invitrogen的Pichia Expression Kit说明书进行配制。
1. 2方法
1. 2. 1基于毕赤酵母偏好密码子的aii A基因密码子优化设计
影响基因在宿主中表达效率的主要因素包括GC含量、tRNA丰度、密码子用法等[20].密码子优化遵循如下规则： （1） 对稀有密码子较为集中的区域进行整体优化，以达到最佳优化效果； （2） 调整富含AT和GC的区域，使序列的GC含量适中； （3） 宿主中的tRNA丰度在很大程度上影响着基因的表达效率，为了防止宿主中可能出现的tRNA衰竭，从而导致转录提前终止的现象，不应在设计基因时全部采用宿主的最优密码子，而是适当使用次优密码子，使密码子和同工tRNA浓度趋于平衡；（4） 为了防止因为复杂序列引起的转录提前终止或者转录效率低下，应当避免优化后的基因出现如“AATAA”、“ATTTA”、“AATTAA”等序列。利用DNA2. 0,参考毕赤酵母密码子偏好性数据表 （ht-tp:/ / www. kazusa. or. jp / codon / cgi-bin / showcodon. cgi?species = 4922&aa = 1&style = N） ,对Aii A蛋白编码序列进行重新设计，根据上述基因优化设计原则进行手动调整，增加后续实验所需的酶切位点（EcoR Ⅰ与Not Ⅰ） ,送上海铂尚生物技术有限公司进行全基因合成，获得含有优化后的aii A基因亚克隆质粒p UC57-Oaii A.
1. 2. 2 Oaii A多拷贝表达载体的构建及验证
利用碱裂解法大量提取质粒p UC57-Oaii A和毕赤酵母表达质粒p PICZαB,将提取的p UC57-Oaii A和p PICZαB分别用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ进行双酶切，分别获取含有相同粘性末端的Oaii A基因和p PICZαB表达载体。利用T4 DNA连接酶将以上两个片段连接后导入E. coli DH5α感受态细胞中，将其均匀涂布于含有Zeocin抗性的 （25 μg·m L- 1） 的固体LLB平板上，于37 °C恒温培养箱中倒置培养12 ~ 16 h.从上述转化后的含Zeocin（25 μg·m L- 1） 的平板上挑取单菌落接种于含Zeocin抗性的（25 μg·m L- 1） 的液体LLB培养基中，37 °C,230 r·min- 1过夜培养。利用碱裂解法提取质粒，以此为模板，进行质粒PCR验证。 PCR反应体系为15 μL:10 × buffer 1. 3 μL,Mg Cl21. 4 μL,d NTP0. 5 μL,引物F1（10 μmol · L- 1） 和引物F2（10 μmol · L- 1） 各0. 3 μL,DNA模板1. 0 μL,r Taq DNA聚合酶 （5 U·μL- 1）0. 3 μL,dd H2O 9. 9 μL. PCR反应条件：94 ° C 3 min,94 ° C 30 s,55 °C 30 s,72 °C 80 s,30个循环，72 °C延伸10 min.经琼脂糖凝胶电泳检测正确后，进行EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切验证目的基因连接在载体上方向的正确性，并将构建的含单拷贝Oaii A基因的载体命名p PICZαB-Oaii A.以p PICZαB-Oaii A为基础，利用Bgl Ⅱ和Bam H Ⅰ这对同尾酶构建含二拷贝和三拷贝Oaii A基因的表达载体，分别命名为p PICZαB-2Oaii A和p PICZαB-3Oaii A.同时通过Bgl Ⅱ和Bam H Ⅰ双酶切验证各表达盒连接的方向。
1. 2. 3重组转化子GS115-p PICZαB-x Oaii A 的表型鉴定
通过分析p PICZαB载体及Oaii A基因的酶切位点，利用Sac I对单拷贝表达载体p PICZαB-Oaii A进行酶切线性化后同二拷贝表达载体p PICZαB-2Oaii A和三拷贝表达载体p PICZαB-3Oaii A通过电转化方式分别整合至毕赤酵母GS115基因组中，构建出多拷贝工程菌GS115-p PICZαB-x Oaii A（x = 1,2,3）。对MD筛选平板上长出的菌落用PCR进一步验证目的基因已成功整合到酵母基因组。 PCR验证后的阳性菌株分别点种于MM和MD平板上，置于28 °C下培养2 ~ 3 d,观察两种平板上菌落的生长状况，若菌落在MM、MD平板上生长状况几乎一致，则该单克隆为甲醇快速利用型转化子 （Mut+） ;若单菌落在MD平板上明显大于MM平板，则该单克隆为甲醇利用慢型转化子 （Muts）。
1. 2. 4 Oaii A多拷贝工程菌GS115-p PICZαB-x Oaii A 的诱导表达
挑取上述验证正确的重组转化子GS115-p PICZαB-x Oaii A接种于5 m L YPD培养基 （ 含100 μg·m L- 1Zeocin） 中，28 °C,230 r·min- 1过夜活化； 取活化培养液500 μL接种于装有50 m L BMGY培养基的250 m L锥形瓶中，28 °C,230 r·min- 1培养至A600为2. 0 ~ 6. 0; 将上述菌液装于50 m L离心管中，8 000 r·min- 1离心5 min收集菌体； 用适量灭菌dd H2O重悬菌体，8 000 r·min- 1离心5 min收集菌体，重复两次； 取适量菌体重悬于装有50 m L BMMY培养基的250 m L锥形瓶中，使瓶中培养液A600约为1. 0,28 °C,230 r·min- 1进行诱导。每隔24 h往培养基中添加甲醇，使其体积分数为1. 0%,诱导72 h后，将培养液装入50 m L离心管中，8 000 r·min- 1离心20 min收集发酵上清液。
1. 2. 5重组Aii A蛋白的检测
利用镍柱亲和层析纯化将GS115-p PICZαB、GS115-p PICZαB-aii A和GS115-p PICZαB-x Oaii A发酵液进行纯化浓缩后，对纯化产物进行SDS-PAGE和Western Blot鉴定。
1. 2. 6 ELISA比较毕赤酵母工程菌Aii A表达量
将重组毕赤酵母GS115-p PICZαB-aii A和GS115-p PICZαB-x Oaii A以1. 2. 4方法诱导后，利用本实验室前期建立的双抗体夹心ELISA的方法对其表达产物进行定量测定，具体操作参见曾世涌等的方法[21].制作Aii A蛋白标准曲线时，将Aii A蛋白标准品稀释至35. 5 μg ·m L- 1后逐步以2倍稀释至1. 11 μg·m L- 1,测定各稀释样品D410 nm值，实验重复3次。以Aii A蛋白浓度的对数lg际上c为X轴，以测定的D410 nm为Y轴作图。
1. 2. 7重组Aii A蛋白活性检测
将GS115-p PICZαB-x Oaii A和GS115-p PICZαB发酵液进行镍柱亲和层析纯化后，分别取适量纯化产物与胡萝卜软腐欧文氏杆菌培养物混匀后均匀涂抹于无菌处理过的马铃薯 （Solanum tuberosum） 的创面上，28 °C温浴16 h后观察。
2结果和分析
2. 1 aii A基因密码子优化设计及全序列合成
