大鼠体内不同剂量P1c对大鼠凝血参数的作用

　　血小板受体和细胞内信号分子的发现为抗血小板治疗提供了新的研究方向，抗血小板药物已广泛用于动脉血栓形成的预防和早期治疗，这些药物以血小板的活化和聚集作为靶点。目前，抗血小板药物主要有ADP受体类似物(如氯比格雷)、凝血酶受体类似物(如E5555)、血栓素形成抑制剂(如阿司匹林)、GPⅡb/Ⅲa受体抑制剂(如阿昔单抗和依替巴肽)等，其抑制血小板作用明显，对防止血栓形成、溶栓治疗、预防血管内再闭塞有明显的作用，但它们的主要不良反应是出血倾向和血小板减少症等。如阿昔单抗是人-鼠嵌合单抗，依替巴肽为蛇毒5肽，两者均为异源蛋白，可引起免疫性血小板减少。因此，寻找一类有效、安全、价廉的抗血小板药物已是当前的研究热点。

　　结缔组织生长因子肽(connectivetissuegrowthfactorpeptide，CTGFP)是一个来源于结缔组织生长因子第4结构域的小肽(被命名为P1c，专利公开号101497656)，由17个氨基酸组成。有研究显示:该小肽具有与人整合素αvβ3中的β3亚基特异性结合及有良好的抗血小板聚集的作用。本研究观察了大鼠体内不同剂量P1c对大鼠凝血参数的影响，现报道如下。

　　1、材料与方法

　　1．1实验药物

　　P1c由上海科肽生物工程有限公司合成，肝素钠注射液由江苏万邦生物医药有限公司提供。

　　1．2动物

　　雄性SD大鼠30只，体重250～280g，购自浙江省实验动物中心，动物许可证号为SCXK(浙)2008-0033。

　　1．3实验方法

　　将大鼠随机分为5组，每组6只，分别为生理盐水组(给予等体积的生理盐水)，肝素钠(50U·kg－1)组，低、中、高剂量P1c(P1c2、4、8mg·kg－1)组，给药容积为0．5ml·(100g)－1，均股静脉注射给药。每天1次，连续5d。末次给药后30min以5%水合氯醛0．7ml·(100g)－1腹腔注射麻醉大鼠，5min后腹主动脉取血4ml置入蓝色帽的vacuette抗凝管(3．8%枸盐酸钠1∶9抗凝)中，颠倒混匀，以3000r·min－1离心10min。将离心好的标本试管编号，放于样本托架上。

　　检查血凝仪配套试剂和每日质控，检测凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)以及纤维蛋白原(FIB)，记录结果。

　　1．4统计学处理

　　所有数据均采用x±s表示，组间比较比较采用t检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

　　2、结果

　　见表1。

　　凝血参数肝素钠组与生理盐水组比较，差异有统计学意义(P＜0．05)，肝素钠显著延长凝血时间，降低纤维蛋白原含量，显示出强大的抗凝作用。凝血参数低、中、高剂量P1c组与生理盐水组比较，差异无统计学意义(P＞0．05)，说明P1c对大鼠的PT、APTT、FIB和TT没有直接作用。

　　3、讨论

　　研究表明，整合素αⅡbβ3是血小板膜的主要受体，不但参与血小板的黏附、聚集等，同时也介导了血小板的信号转导，是血小板活化、聚集的最终共同通路。阻断整合素αⅡbβ3可以有效地抑制各种激动剂诱导的血小板聚集，是抗血栓治疗的理想靶点。但受体拮抗剂主要的潜在不良反应是出血，使得这类药物未能较好地在临床推广。

　　在前期的研究中证实，P1c可以有效地减少ADP诱导的血小板的聚集，也可以抑制ERK1/2的磷酸化，证实P1c与αⅡbβ3结合及其可能的作用原理是通过抑制ERK1/2的磷酸化而实现的，P1c对大鼠动静脉旁路血栓形成的影响从体内水平证实了P1c抗血栓形成的有效性。P1c是人源性小肽，为了更好的阐明其对凝血系统的安全性，本实验首次观察了P1c对大鼠凝血参数的影响。

　　经典瀑布学说认为，凝血过程是一系列的酶促反应，其中包括内源性、外源性途径和共同通路，最后使纤维蛋白原变为纤维蛋白，血液由溶胶状态变为凝胶状态。PT值是反映外源性凝血因子是否异常的指标，同时用于监测口服抗凝剂的用量，是监测口服抗凝剂体内水平的首选指标;APTT值是反映内源性凝血因子是否异常的指标;而TT值则主要反映凝血共同途径FIB转变为纤维蛋白的过程中，是否存在异常抗凝现象的指标。FIB即凝血因子Ⅰ是凝血过程中的主要蛋白质，含量与凝血酶活性有关，在血栓形成过程中，凝血酶的激活是主要因素之一。PT、APTT和FIB三者同时监测已被临床用于筛查患者的凝血机制是否正常。通过大鼠体内实验研究发现，具有抗凝血作用的肝素钠可以显著延长凝血时间和降低FIB含量，显示出强大的抗凝作用(P＜0．05)。而对大鼠进行连续5d给予低、中、高剂量的P1c后，测定的凝血参数结果显示，低、中、高剂量的P1c与生理盐水组比较差异均无统计学意义(P＞0．05)，表明P1c不改变大鼠凝血参数PT、APTT、FIB和TT，不影响大鼠的凝血功能。

　　总之，目前已有多种以血小板αⅡbβ3整合素为靶点的抗血小板药的报道，其中部分已经应用于临床，如阿昔单抗和依替巴肽静脉给药用于急性冠脉综合征患者经皮冠脉介入短期治疗。本研究结果为进一步研究P1c抗血小板及抗血栓作用提供了实验基础。