分子生物学论文
家蚕( Bombyx mori) 基因组框架图、精细图以及各种数据库的相继建立和不断完善，为发掘和鉴定家蚕基因、研究基因的生物学功能及应用前景奠定了良好的信息平台基础。lemon ( lem) 是一种典型的黄体色家蚕突变体，其幼虫体表富含墨蝶呤( se-piapterin，SP)。SP 属于喋啶类化合物，是 GTP 分解代谢途径的中间产物。在高等动物中，SP 是补救途径合成四氢生物蝶呤( tetrahydrobiopterin，BH4) 的前体，经墨蝶呤还原酶( sepiapterin reductase，SPR) 和二氢叶酸还原酶( dihydrobiopterin reductase，DHFR)催化完成( 图 1)。【图略】
SPR 是以 NADPH 为辅酶催化蝶啶衍生物代谢的醛酮还原酶，由 GTP 分解到 BH4 生成的从头合成途径中，SPR 是催化最后一步反应的必需酶，对于生物体合成 BH4 具有非常重要的生理功能。BH4是芳香族氨基酸羟化酶的必需辅酶，也是一氧化氮合酶的重要辅助因子。BH4 的合成不足会导致神经递质的缺乏以及细胞内皮功能障碍，引发多种神经性生理代谢疾病。我们的前期研究表明，家蚕 SPR( BmSPR，Gen-Bank 登录号: AB465548 ) 基因 ( BmSpr) 的全长 ORF为 801 bp。与哺乳动物 SPR 类似，BmSPR 是家蚕体内合成 BH4 的重要酶之一，其活性的严重缺乏会导致幼虫因 BH4 的合成不足而死亡。家蚕 lem 突变体是提取和纯化获得天然 SP 的重要遗传资源。
为了将从 lem 中大量提纯的 SP 应用于 BH4 的体外生物合成研究，本文对重组质粒 pET-24b-BmSpr 的原核表达系统进行了优化，得到了稳定表达 BmSPR 融合蛋白的实验条件，并对纯化获得的重组蛋白进行了酶学鉴定及活性分析。
1 材料与方法
1． 1 材料及主要试剂
重组质粒 6 × His pET-24b-BmSpr 由本实验室前期构建; E． coli 感受态细胞 Rosetta ( DE3) 和 BL21( DE3) 购自北京全式金公司; PCR 扩增相关试剂购自 TaKaRa 公司; Anti-His Antibody、羊抗鼠 IgG-HRP、HRP-DAB 底物显色试剂盒为 Tiangen 公司产品; 蛋白纯化、蛋白定量试剂盒分别为 QIAGEN 公司和上海生工生物工程有限公司产品; PD-10 蛋白脱盐柱购自 GE 公司; Immobilon-P PVDF 膜为 Millipore 公司产品; SP 标准品及 NADPH 购自 Sigma 公司，其他试剂均为国产分析纯。
1． 2 菌落 PCR
1． 2． 1 检测阳性克隆的引物序列正向引物: M13F，5＇-GTTTTCCCAGTCACGAC-3＇;反向引物: M13R，5＇-CAGGAAACAGCTATGAC-3＇。
1． 2． 2 PCR 反应体系 25 μL 反应体系中含 10 ×扩增缓冲液 2． 5 μL，0． 3 U Tag 酶和 0． 2 ～ 0． 5 μg 模板 DNA，dNTP Mix、正反向引物的终浓度分别为 0． 8mmol / L、0． 4 μmol / L 和 0． 4 μmol / L，最后用 ddH2O补齐。
1． 2． 3 PCR 反 应 参 数 的 设 定 95 ℃ 预 变 性10 min，反应 25 个循环，每个循环包括 94 ℃ 变性55 s，54 ℃ 退火 58 s，72 ℃ 延伸 1 min。循环结束后72 ℃ 延伸 10 min，反应产物用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测确认。
1． 3 优化重组蛋白表达条件
运用热击法将 pET-24b-BmSpr 重组质粒分别转化到 BL21 ( DE3) 及 Rosetta ( DE3) 菌株感受态细胞，37 ℃ ，150 r / min 活化一个小时后，将 100 μL 菌液均匀涂布于 LB 平板( 含 15 μg/mL Kanamycin) ，37 ℃培养过夜。挑取经菌落 PCR 鉴定的阳性克隆，接种到含 Kanamycin 的 LB 液体培养基中，37 ℃，180 r/min 震荡培养至 OD600≈0． 5 时，加入 1． 0 mmol/L 的IPTG 诱导重组蛋白的表达，对照组不加 IPTG。诱导4 h 后，收集菌体，超声波破碎，离心，分别收集上清和细胞沉淀，进行 SDS-PAGE 检测，分析不同菌株中重组 BmSPR 蛋白的表达情况。以 1． 0 mmol/L 的 IPTG 诱导浓度，对照组不加IPTG，分别使用 4 ℃ 、16 ℃ 、28 ℃ 和 37 ℃ 诱导培养4 h后，收集菌体总蛋白进行 SDS-PAGE 检测，分析不同诱导温度下重组 BmSPR 蛋白在 Rosetta ( DE3) 宿主菌中的表达情况。使用不同浓度 梯度的 IPTG( 0．2、0．4 、0．6 、0． 8 、1． 0 、1． 2 、1． 5 和 2． 0 mmol/L)和不 同 诱 导 培 养 时 间 ( 0、1、2、3、4、5 和 6 h) ，于 37 ℃诱导重组蛋白在 Rosetta ( DE3) 中的表达。收集菌体总蛋白进行 SDS-PAGE 检测，分析重组蛋白在不同诱导条件下的表达情况。
1． 4 大量诱导表达融合蛋白
在 37 ℃培养条件下，用 250 mL 的 LB 液体培养基培养含重组质粒 pET-24b-BmSpr 的 E． coli Rosetta( DE3) 的阳性菌株，用 0． 4 mmol/L 的 IPTG 诱导重组蛋白的表达，最后破碎细胞收集上清液，进行 SDS-PAGE 检测。
1． 5 蛋白纯化及免疫印迹检测
扩大培养后，4 ℃ 8 000 r/min 离心 10 min 收集E． coli 细胞，超声破碎，并收集细胞破碎上清液。参照说明书，用 Ni-NTA 亲和层析柱( QIAGEN) 对重组蛋白进行纯化。经 10% SDS-PAGE 电泳检测确认后，将凝胶上的蛋白转至 PVDF 膜上，以 His-Tag 单克隆抗体( Tiangen) 为一抗，羊抗鼠 IgG-HRP 抗体( Tiangen) 为二抗，进行 Western blot 分析，然后参照 HRP-DAB 显色试剂盒 ( Tiangen) 说明书进行显色反应。
1． 6 酶活特性分析
使用 BCA 法试剂盒( 上海生工) 对纯化后的蛋白进行定量，并参照 Katoh的方法，进行 SPR 酶活性分析。反应体系为 0． 1 mL( 含 100 mmol/L 磷酸钾缓冲液 pH 6． 4，SP 50 μmol/L，NADPH 100 μmol/L) ，加入 0． 2 μg 重组酶蛋白，37 ℃ 反应 10 min 后，在420 nm 处测定底物 SP 的 OD 值变化。对照组则不加重组蛋白。根据反应前后 SP 吸光值的变化和标准曲线计算酶活单位。酶活力单位定义为: 每分钟还原 1 nmol SP 所需的酶量 ( nmol/min·μg-1) 。设定不同 梯度的温 度 ( 20-90 ℃) 和 反 应 液 pH ( 20mmol / L Britton-Robinson buffer，pH 2． 0-12． 0 ) ，检测不同温度及 pH 对酶活性的影响，探究重组蛋白的最适反应条件。
2 结果与分析
2． 1 BmSPR 体外表达条件的优化
筛选转化成功的重组质粒阳性克隆，经菌落PCR 排除假阳性，并经测序( 上海生工) 确认序列准确无误，用 IPTG ( 1． 0 mmol/L) 诱导重组子在不同宿主细胞的表达。菌落 PCR 结果如图 2 所示，PCR 产物大小约为 800 bp，与预期相符。SDS-PAGE 结果显示，经 IPTG 诱导后，在 E． coli 菌株 Rosetta ( DE3) 及BL21 ( DE3) 的细胞破碎上清液中均出现大小约为30 kDa 的特异性条带，与目的蛋白的预测分子量相符，且两菌株之间的表达量没有明显差异 ( 图 3) ，在细胞沉淀中目的蛋白的表达量相对较少( 数据未附) 。【图2-3.略】
以 Rosetta( DE3) 为宿主菌，使用 1． 0 mmol/L 的IPTG 诱导，分别以 4 ℃ 、16 ℃ 、28 ℃ 和 37 ℃ 诱导表达 4 h，分析重组蛋白在不同诱导温度条件下的表达情况。结果如图 4 所示，无 IPTG 诱导时，SDS-PAGE未检测到目的蛋白的表达，37 ℃ 诱导条件下目的蛋白的表达量明显高于其他诱导温度。
以 Rosetta( DE3) 为宿主菌，在 37 ℃ 的培养条件下，通过改变 IPTG 浓度 ( 0． 2-2． 0 mmol/L) 及培养时间 ( 1-6 h) ，分析重组蛋白在不同诱导培养条件下的表达情况。结果如图 5 所示，无 IPTG 诱导时，SDS-PAGE 未检测到目的蛋白的表达，而不同 IPTG诱导浓度( 图 5A) 之间及不同诱导时间( 图 5B) 之间对目的蛋白的表达量几乎没有影响，表明重组蛋白在该表达系统能够稳定表达。
2． 2 BmSPR 蛋白的纯化及 Western blot 检测
根据 上 述 表 达 条 件 的 优 化 结 果，以 E． coliRosetta ( DE3 ) 菌株为宿主菌，用 0． 4 mmol / L IPTG大量诱导 BmSPR 的体外表达，培养 3 h 后破碎细胞，收集上清液蛋白，SDS-PAGE 确认了重组蛋白的表达( 图 6A) 。【图略】
用 Ni-NTA 亲和层析柱对重组 BmSPR 蛋白进行纯化，SDS-PAGE 检测得到符合预期分子量大小的单一条带，初步说明重组蛋白纯化效果较佳 ( 图 6B) 。
Western blot 检测发现，经 IPTG 诱导且纯化过的蛋白得到特异性条带，而对照组( 未经诱导) 没有检出信号，再次证明了所表达和纯化的蛋白为目的重组蛋白 BmSPR( 图 6C) 。【图略】
2． 3 BmSPR 的酶活性分析
如图 7A 所示，BmSPR 在 40-70 ℃ 的温度范围内，保持较高的活性，50 ℃为最适反应温度。为分析pH 对 BmSPR 活性的影响，使用终浓度为 50 mmol / L不同 pH ( 2． 0-12． 0) 的 Britton-Robinson buffer，酶蛋白加入各反应体系，于 37 ℃反应 10 min 后计算酶活性。如图 7B 所示，BmSPR 在 pH 4-6 之间表现出较高的酶活性，pH 5 为最适 pH 值。3 讨论本实验用 E． coli 不同菌株 ( 图 3) ，通过改变诱导温度、IPTG 诱导浓度和诱导时间对家蚕 SPR 的体外表达条件进行了优化 ( 图 4，图 5) ，最终选用 E．coli Rosetta ( DE3 ) 对其进行大量诱导表达分析，SDS-PAGE 和 Western blot 的检测结果表明 BmSPR融合蛋白能够在原核表达系统中稳定表达( 图 6) 。【图略】
以 SP 为反应底物，用分光光度法分析所纯化蛋白的酶活性的数据显示，当温度为 50 ℃、pH 值为 5 时，BmSPR 对 SP 表现出良好的催化活性( 图 7 ) ，为通过表达重组 BmSPR 的方式，开展体外合成制备 BH4 的课题研究提供了重要依据。
作为芳香族氨基酸羟化酶和一氧化氮合酶的重要辅酶，BH4 的合成缺陷会引起肌张力低下、不明原因的高热、发育迟缓、脑脊液中神经递质代谢产物的浓度偏低等神经系统疾病; 同时也是导致高血压、动脉粥样硬化、糖尿病等内皮功能异常的重要原因。口服 BH4 已被作为临床治疗其中某些疾病的常规方案。然而经化工合成市售的 BH4 价格非常昂贵。因此，低耗高效的 BH4 生产工艺的开发创立显得十分必要。随着与 BH4 合成相关的酶如 GTPCHI、PTPS、DHPR、SPR以及 DHFR等的研究日益增多，酶基因的克隆与功能鉴定，蛋白质晶体结构的探明，使得 BH4 合成代谢的调控通路愈发清楚。这些研究一方面有助于加速对 BH4 缺乏症实现基因治疗的进程，另一方面为非化工途径合成 BH4 的应用基础研究奠定必要的理论基础。
原核表达系统是目前应用最普遍的基因工程蛋白表达系统，具有操作 简 单、高 效 低 廉 等 明 显 优势。我们利用大肠杆菌表达系统，获得了纯度较高、催化活性较好的重组 BmSPR( 图 6，7) 和 BmDH-FR。家蚕 lem 突变 体 的 幼 虫 体 表 沉 积 大 量 的SP，本课题组已建立了从 lem 蚕高效地分离纯化 SP 的实验体系，并且对 BH4 的补救合成途径所需要的两个酶进行了分子克隆和功能分析。
下一步我们打算利用从 lem 突变体大量提取的 SP 为底物，筛选共表达 BmSPR 和 BmDHFR 的工程菌，进行体外合成制备 BH4 的研究试验，以期获得一种较为简便有效的合成 BH4 的方法。