分子生物学论文
钙调神经磷酸酶 ( calcineurin，CaN) 是在 20 世纪 70 年代末至 80 年代由王学荆教授、美国 Klee 教授及张槐耀教授首次在猪大脑中发现的，并将其纯化成功，因为其在动物神经元中广泛存在并结合钙调素 ( CaM) 发挥作用，故命名为钙调神经磷酸酶。CaN 受 Ca2 +信号调控而发挥多种生物功能，而CaN 自身不但是多条信号传导通路的中心环节，而且还可以通过去磷酸化作用使 Ca2 +信号和其他调节机制偶联起来，进而对其他信号通路进行调节，发挥其生物学调节作用，是细胞在信号调控与信号传递中的效应酶和调节酶。CaN 分布广泛，在多系统中发挥着生物学效应，如心血管系统、神经系统、运动系统及肿瘤等。CaN 介导的信号通路在心血管系统中的作用研究比较成熟，本文就 CaN 的生物学特征及其在心血管重塑中的作用做一综述。
1 CaN 的分子结构
CaN 属丝 / 苏氨酸蛋白磷酸酶家族成员 ( 又称蛋白磷酸酶2B，PP2B) ，受 Ca2 +/ CaM 的调节，其在体内广泛存在，含量最高的为 T 淋巴细胞和神经组织，其次为骨骼肌和心肌，在肝、肺、脾、胰、肾及子宫平滑肌均存在。CaN 由一个催化亚基 ( CnA，59 －62 KDa) 和一个调节亚基 ( CnB，19 KDa) 组成，其中 CnA 亚基由521 个氨基酸组成，CnB 亚基由168 个氨基酸组成。CnA 亚基包含有催化域、CnB 结合域、CaM 结合域、N － 末端区及自身抑制区。CnB 亚基有 4 个 Ca2 +结合位点，只有当 Ca2 +与 CnB 亚基结合在一起时才能激活其磷酸酶活性。从 CaN 的晶体结构中可以看到，当 CaM 结合域向后弯曲时，其催化域被自身抑制区封闭，从而使其磷酸酶活性被抑制; 当 Ca2 +与 CaM 结合时，自身抑制区移位，暴露催化域的活性位点，从而活化 CaN。目前 CaN 的 3 种基因已被发现，CnA 亚基由 2 种基因表达，即 α 和 β 基因，分别位于人第 4、10 号染色体; CnB 亚基由 1 种基因表达，位于人第 2 号染色体。CnA 亚基分为 CnAα、CnAβ、CnAγ 3 种亚型。心肌重构主要由 CnAβ 参与，根据 C 末端的不同又可分为 CnAβ1和CnAβ2。
2 CaN 的酶学特征
CaN 具有相对比较专一的酶作用底物，其生理性底物中比较重要的有活化 T 细胞核因子家族 ( NF － ATs) ，三磷酸肌醇( IP3) 受体，经由 多巴 胺及 cAMP 活 化调 节 的磷酸蛋白( DAＲPP －32) ，N － 甲基 － D － 天冬氨酸受体 ( NMDA) 等。
CaN 的底物专一性可能通过与锚着蛋白结合而定位在特定的区域来实现。单独的催化亚基的活性非常低，只有 CnA 和 CnB两个亚基紧密结合后才能发挥 CaN 高效特异的催化活性。
Ca2 +通过与 CaM、CnB 亚基的结合来实现对 CaN 活性的调节。
Ca2 +与 CaM 结合可形成 Ca2 +－ CaM 复合物，可导致 CaM 的构象发生变化，进而与 CaN 结合形成复合物。如果与 CaN 形成复合物的 CaM 只结合了 2 个 Ca2 +，那么该复合物并没有活性，只有当该复合物再结合 1 ～ 2 个 Ca2 +后才会具有活性。因此，Ca2 +/ CaM 激活 CaN 的过程中，限速步骤不是 Ca2 +与 CaM 结合，也不是 Ca2 +－ CaM 复合物与 CaN 结合，而是细胞中持续较高浓度的 Ca2 +的存在。CaM 对 CaN 的主要作用表现为增加反应的 Vmax，但不影响 CaN 与底物的亲和性。Ca2 +与 CnB 亚基结合可增加 CaN 与底物的亲和力，但不改变 Vmax，但同时也是 CaN 活化所必需的，这样就保证了 CaN 活性对 Ca2 +浓度瞬变的依赖性。有学者认为，H+可能和 Ca2 +一样参与了 CaN活性的调节，但作用机制不同: H+通过暴露 CaN 上的 CaM 结合域而调节 CaN 活性。金属离子也是 CaN 活化所必需的，CaN 的催化功能受多种金属离子的调节。体外实验表明，不同的金属离子对 CaN 的激活能力不同，同时还受 pH 和金属离子浓度的影响。CaN 有特异的抑制剂，如环孢霉素 A ( CsA) 和他克莫司 ( FK506) ，生理性抑制剂如 Cain 蛋白 ( 神经组织中纯化得到) 和 regucalcin 蛋白 ( 肝细胞中获得) 。此外，CaN也受蛋白激酶调节，蛋白激酶磷酸化 CaN 后可使其活性降低。
3 CaN 在心肌肥厚中的作用
心肌肥厚是心脏在各种体内外刺激因素作用下发生的一种代偿性反应，主要表现为细胞增大、间质细胞增生、胞外基质重构及胚胎基因的再表达，这也是心室重塑的过程。肥大的心肌细胞体积增大、合成蛋白增加、肌节数量增多，在机械牵张、压力 负 荷、缺 血、缺 氧、活 性 氧 及 炎 性 因 子 等 刺 激下，通过多种复杂的途径导致心肌肥厚的发生和发展。研究发现，高血压、肥厚性心肌病、冠心病、扩张型心肌病、缺血性心脏病、瓣膜性心脏病引起的心室重构心力衰竭患者，其血清或心肌中 CaN 活性均增高。各种体内外刺激因素通过不同方式与作用机制改变细胞内 Ca2 +浓度，进而导致 Ca2 +结合 CaM 激活效应酶———钙调素激酶 ( CaMK) 、CaN，启动信号通路，产生生物学效应。活化 T 细胞核因子 ( NFAT) 是一种多功能因子，由 T 细胞受抗原刺激后产生，目前研究认为NF － ATs 共有 5 种蛋白 ( NFAT 1 ～ 5 ) ，哺乳动物的心脏以NFAT3 为主，活化的 NFAT3 在心肌肥厚的发生中扮演着重要角色，同时其还可以与其他因子结合而参与调节心肌肌球蛋白重链 ( MHC) 和心房利钠因子 ( ANF) 等基因的表达，从而影响心肌功能。NFAT 是 CaN 重要的下游靶点，CaN 去磷酸化 NFAT3 暴露其核定位信号，转位进入细胞核，核内 CaN、NFAT3、锌指转录因子 ( GATA4) 形成复合物，共同激活下游基因，引起心钠肽、脑钠肽、α － MHC、β － MHC 特异表达。正常情况下，MHC 以 α － MHC 表达为主，而肥大心肌的MHC 则以 β － MHC 为主，从而影响了心肌纤维的收缩力，导致心力衰竭的发生。此外，心脏成纤维细胞转移生长因子 β( TGF － β) 合成增加可以诱导心肌细胞原癌基因表达，如c － fos、c － myc、c － jun 等，进而使心肌胚胎化、蛋白核酸合成增加，导致心肌肥大。在慢性缺氧诱导的右心室心肌肥厚大鼠中发现，右心室心肌 CaN 活性、CnAβ mＲNA 及 NFAT3明显增高，利用 CaN 抑制剂 CsA 降低 CnAβ mＲNA 的表达及CaN 活性后，大鼠心肌肥厚程度减轻，证实 CnAβ / NFAT3 通路在慢性缺氧所致右心室心肌肥厚中发挥着重要作用。但 CsA是一种免疫抑制剂，有较大不良反应，故而不宜在临床上长时间应用。不少传统中药治疗心肌肥厚的作用机制也可能通过 CaN 通路，研究表明，高浓度丹参酮能够明显减低压力负荷所致心肌肥厚大鼠心肌 CaN 的表达，从而抑制心肌肥厚，且这一作用与缬沙坦相当。当然，其他信号通路也可能参与了心肌肥厚的发生和发展过程，不同信号通路间可能存在交互作用。
4 CaN 在血管平滑肌增殖中的作用
血管平滑肌细胞 ( VSMC) 增殖是动脉粥样硬化、经皮冠状动脉介入治疗 ( PCI) 后再狭窄的一个重要病理改变。基础研究表明，细胞内 Ca2 +浓度在细胞增殖、凋亡、基因表达等方面发挥着至关重要的作用。VSMC 膜上的 L 型 Ca2 +通道是Ca2 +进出细胞的主要通道，由两种负反馈机制负责调控，其一为 CaN 介导的去磷化过程，其二为细胞内 Ca2 +与膜蛋白上相关部位的相互作用。CaN 通过去磷酸化调节 VSMC 膜上的 L 型钙离子通道的活性而影响胞内 Ca2 +浓度，进而启动信号通路，调节 VSMC 增殖等。研究发现，NFAT 蛋白在 VSMC 中表达，不同刺激物可以信号传递的方式激活细胞内 NFAT，导致VSMC 核内相关基因转录，引起细胞增殖，CaN 特异性抑制剂CsA 能 够 阻 断 CaN 对 NFAT 的 激 活， 进 而 抑 制 VSMC 增殖。有体外实验采用雷尼丁刺激大鼠 VSMC 内 Ca2 +的释放，结果显示细胞蛋白、核酸合成明显增高，CaN 抑制剂 CsA及钙道阻滞剂维拉帕米能够抑制雷尼丁介导的血管平滑肌蛋白、核酸合成增高，并且抑制 CaN 的活性。有在体实验对大鼠腹主动脉进行球囊损伤而引起管腔狭窄，CsA 能够抑制增生、减轻血管损伤后的狭窄，并抑制 CaN 及 NFAT3 的表达，从而证实 CaN 通路参与了血管平滑肌的增殖与迁移，为临床治疗 PCI 后再狭窄提供了新思路。其他的信号通路如 JAK－ STAT 通路、MAPK 通路等也可能共同参与了 VSMC 的增殖。
5 CaN 与心房纤颤 ( AF) 、心房肌肥大及心房电重构的关系
AF 是常见的心律失常，可增加脑卒中等血栓栓塞事件发生率。研究证实，AF 可引起心房肌细胞组织学及电生理学的显着变化，且这些变化与细胞内 Ca2 +超载相关，细胞膜上的 L型 Ca2 +通道在 Ca2 +超载过程中起主要作用。肥大的心房肌细胞影响了腔室的几何学、机械性能及各向异性传导，易导致心律失常的发生。Bukowska 等研究表明，在房性快速型心律失常患者心房肌细胞重构的作用机制中，Ca2 +依赖的 NFAT4通路发挥着重要作用，心房肌细胞肥大使 AF 持续存在并继续发展。研究表明，左心房直径与 NFAT3 的表达呈正相关，这一结果支持腔室的几何学及组织结构变化是 CaN 依赖性的，而腔室结构变化引起的血流变化则增加了血栓栓塞事件的发生率。研究表明，小剂量 FK506 与自由基清道夫药物 Egb( 761) 联合应用具有抗心律失常作用，提示通过抑制 CaN 信号通路能够抑制心房重构，进而抑制 AF 的发生和发展，但FK506 作为免疫抑制剂，其在慢性 AF 患者长期治疗中的应用同样受到了限制。此外，心房快速起搏也可以改变心房肌细胞的电生理特性，缩短动作电位有效不应期 ( EＲP) ，降低 EＲP的频率适应性，导致心房电重构及 AF 的发生和维持。颜伟等研究表明，采用 CsA 对持续心房起搏犬心房电生理特性进行干预，能够抑制心房快速起搏导致的心房 EＲP 的缩短，但实验的最终结果并没有改变 AF 的诱发与维持，提示 AF 的发生还可能与其他通路作用有关，单纯阻断某一通路可能并不能达到满意的治疗效果。
综上所述 ，CaN 是具有临床多效性的一种酶，在心血管重塑中发挥着重要作用，有可能成为临床治疗心血管重塑的新靶点。在心血管重塑发生和发展过程中，CaN/NFAT 信号通路与其他信号通路可能存在交互作用，但其具体作用机制还有待于进一步研究。
参考文献
1 Sakuma K，Yamaguchi A. The functional role of calcineurin in hypertro-phy，regeneration，and disorders of skeletal muscle ［J］． J BiomedBiotechnol，2010，2010: 721219．
2 符民桂，唐朝枢 . 钙调神经磷酸酶的研究进展 ［J］． 生物化学与生物物理进展，2000，27 ( 2) : 157 －161．
3 Karatas A，Hegner B，de Windt LJ，et al． Deoxycorticosterone acetate－ salt mice exhibit blood pressure － independent sexual dimorphism［J］． Hypertension，2008，51 ( 4) : 1177 －1183．
4 Yamazaki T，Komuro I，Yazaki Y. Signalling pathways for cardiac hy-pertrophy ［J］． Cell Signal，1998，10 ( 10) : 693 － 698．