分子生物学论文
蛋白质是人类赖以生存和发展的物质基础，它不仅是构成细胞的基本有机物，而且是生命活动的主要承担者，没有蛋白质就没有生命。蛋白质的主要来源是肉、蛋、奶和豆类食品，一般而言，动物蛋白品质较高，含有充足的必需氨基酸。必需氨基酸有 8 种，无法由人体自行合成，必须从食物中摄取。蛋类含蛋白质 11%~14%,是优质蛋白质的重要来源。蛋类作为中国居民重要动物性食品之一，其营养丰富，为人类蛋白质的主要来源。蛋中含有优质蛋白质、脂肪、卵磷脂、矿物质、维生素等营养成分，其蛋清中含卵白蛋白，蛋黄蛋白质含量丰富，蛋白质的消化吸收率高，对人体生长十分有益。
鸡蛋是人类获得蛋白质的主要来源之一，其质量安全关系到人体健康，更是关系国计民生的重大问题。鸡蛋的质量高低，尤其是蛋品的真伪关系到千家万户的饮食安全。近几年，一些不法商贩为了牟取暴利，采用化学试剂人工合成鸡蛋，"人造鸡蛋"在深圳、杭州等地己相继被发现，严重损害了消费者的健康。研究表明，"人造鸡蛋"与真鸡蛋蛋壳的主要成分都是碳酸钙，但是蛋清蛋黄的成分不同，人造鸡蛋中主要成分是树脂、淀粉、凝固剂、色素等化学物质，毫无营养价值且对人体有害。目前国家尚未出台相关标准检测真伪鸡蛋，消费者仅能凭感觉和经验识别，无法实现对蛋品真伪的现场技术检测。汤青萍等对仿土鸡蛋的蛋品质分析及变化规律进行了研究，主要集中在蛋白质的含量、蛋黄蛋白比、维生素含量上，没有提及区分假鸡蛋的检测方法。
分子检测技术是一种利用现代生物技术水平的检测技术，具有灵敏度高、选择性好、特异性强等优点，是新时期食品安全的战略制高点之一。与常用的毛细管电泳法、光谱法以及各种联用技术如气质联用等法相比，后者虽然灵敏度高、测量结果准确，但是操作复杂、设备价格昂贵、费时费力、不易携带、检测成本高。因此，采用分子检测技术对市售鸡蛋进行分析。结果表明，本方法快速、简便，为商品检验人员对蛋品市场进行广泛的监测提供科学的手段，为保护消费者权益提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鸡蛋，购于黄桷垭市场；农村土鸡蛋，农户购买。
电子精密天平，上海奥豪斯公司；DYCZ-24D 双垂直电泳槽；DYY-6C 电泳仪，北京六一生物科技有限公司。丙烯酞胺、N-N 亚甲基双丙烯酚胺、三羟基甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸钠、过硫酸胺、三氯醋酸、考马斯亮蓝 250、甲醇、冰醋酸，均为分析纯。
1.2 试验方法
1.2.1 引物设计
参见卵清蛋白基因设计 , 上游引物5'GACACAGATAAATAAGGTTGTTCGC-3', 下游引物 5'TTTCTCAGAAGCCATTGATGATGCCACT-3',引物由 TaKaRa 公司合成。
1.2.2 卵清蛋白基因 PCR 扩增
选取 7 种市售鸡蛋，提取鸡蛋的基因组 DNA.
用枪头取蛋清 100 μL 于 1.5 mL 离心管中，加入500 μL 核酸裂解缓冲液，混匀后于恒温箱中 65 ℃反应 1 h,期间不时摇匀；在样品液中加入等体积酚 / 氯仿 （1/1,v/v），混匀，于台式低温离心机4 ℃下 12 000 r/min 离心 5 min;取上清于干净离心管中，加入等体积氯仿 / 异戊醇 （1/1,v/v），混匀，于 4 ℃下 12 000 r/min 离心 5 min;取上清于干净离心管中，加入 2 倍体积冷的无水乙醇，-20 ℃放置过夜，于 4 ℃下 12 000 r/min 离心 5 min,小心去上清，加 500 μL 70%乙醇，于 4 ℃下 12 000 r/min离心 5 min,小心去上清，空气中晾干，加入 200 μL无菌水，充分溶解，DNA 溶液保存于 -20 ℃。以其做模板，用引物扩增卵清蛋白，扩增 PCR 片段，反应在 PE DNA 9600 仪器中进行。PCR 循环参数：
变性阶段 94 ℃，5 min;循环阶段 94 ℃，1 min,55 ℃，35 s,72 ℃，1 min,共 30 次；复性阶段72 ℃，10 min,凝胶电泳分析。
1.2.3 卵黄蛋白的 SDS-PAGE 电泳
选取 7 种市售鸡蛋，用枪头取蛋黄 100 μL,裂解液提取鸡蛋黄蛋白质，BCA 法测定蛋白质浓度（生工试剂盒），并进行 SDS-PAGE 蛋白质电泳，上样量为 20 μg/mL.
1.2.4 鸡蛋卵磷脂的检测
卵磷脂在蛋黄中含量较高，通过提取卵磷脂也可检测鸡蛋的成分。取 100 μL 蛋黄，1 mL 冷丙酮，混匀 10 000 r/min 离心 10 min,取沉淀，加入 5 mL石油醚和 15 mL 乙醇，放入烧杯中混合均匀。离心10 000 r/min 离心 10 min,收集上清。将滤液收集，旋转蒸发，旋转蒸发仪温度设为 40 ℃。收集产品，进行薄层层析检测。
2 结果与分析
2.1 卵清蛋白基因 PCR 结果与分析
卵清蛋白是动物卵中的贮藏蛋白，给发育中的胚胎提供氨基酸，也是食物中重要的蛋白质来源，对人体健康具有多种改善和提高作用。通过检测卵清蛋白能进行鸡蛋真伪的鉴别。
卵清蛋白基因 PCR 电泳片段约为 520 bp,结果如图 1 所示。此片断经测序后，序列与已登录的鸡卵清蛋白基因序列一致。由图 1 可知，市售真鸡蛋与农村土鸡蛋的卵清蛋白扩增片段一致。由于人造鸡蛋主要树脂、淀粉、凝固剂、色素等化学物质，如果进行 DNA 提取后，根本无法获得卵清蛋白基因 PCR 扩增结果，检测应该为无电泳条带。故此图中未显示假鸡蛋的电泳条带。
2.2 卵黄蛋白的 SDS-PAGE 电泳结果与分析
鸡蛋的卵黄中含有大量的蛋白质，每 100 g 鸡蛋含蛋白质 12.8 g,蛋黄多居于蛋白的中央，由系带悬于两极。蛋黄体积约全蛋的 30%~32%,主要组成物质为卵黄磷蛋白，其中含有人体必需的 8 种氨基酸，并与人体蛋白的组成极为近似，人体对鸡蛋蛋白质的吸收率可高达 98%.
SDS-PAGE 电泳既可分析蛋白质的纯度，也可对蛋白质的浓度进行鉴定分析，它在生化物质分析及生物活性物质的分离、制备中和纯度鉴定中具有广泛应用前景。
通过提取鸡蛋蛋黄发现，在同样的体积下，5泳道的蛋白质染色要比 2~4 泳道的蛋白质染色条带深，表明其总蛋白质含量农村土鸡蛋要大于鸡场鸡蛋，但其两者的电泳图的图形条带数量差别不大，结果见图 2.但如果要进行农村土鸡蛋与鸡场鸡蛋的分子鉴定，用该方法不精确，应进一步进行农村母鸡和鸡场母鸡的微卫星序列鉴定分析才能确定，故本试验中的方法不适合农村土鸡蛋和鸡场鸡蛋的鉴定分析。
2.3 鸡蛋卵磷脂的检测结果与分析
鸡蛋卵磷脂也可作为一检测指标，蛋黄卵磷脂中的主成分是磷脂酰胆碱 （PC），卵磷脂是细胞膜的主要组成成分，适量补充卵磷脂有利于细胞的新陈代谢，恢复组织器官的功能，延缓衰老。鸡蛋蛋黄卵磷脂薄层图谱如图 3 所示。鸡蛋样品具有卵磷脂，如果是假鸡蛋，由树脂、淀粉等构成，根本不可能有卵磷脂的阳性结果存在，故卵磷脂的薄层层析检测也可作为鉴别真假鸡蛋的方法。
3 讨 论
本试验结果显示，市售鸡场鸡蛋与农村土鸡蛋都有共同的扩增卵清蛋白基因片段，市售鸡场鸡蛋与农村土鸡蛋的 SDS-PAGE 凝胶电泳条带类似，这两种均可作为分子技术检测蛋白质的方法。该检测技术可避免以往单凭感官检验的缺陷，可作为一种准确、快速、高效的检测真假鸡蛋的有力措施。而对于市售假鸡蛋，这两种检测方式都无法获得阳性结果，即不能通过鸡蛋的 DNA 提取获得卵清蛋白的基因片段，也不能通过 SDS-PAGE 凝胶电泳获得相应的蛋白质条带。鸡蛋的卵磷脂薄层层析图也显示，如果是真鸡蛋，则会有卵磷脂的存在，可通过薄层层析检测到阳性结果，否则没有。鸡场鸡蛋与农村土鸡蛋检测结果表明，这 3 种方法都可以作为真假鸡蛋的鉴定方法，而农村土鸡蛋与鸡场鸡蛋的区别如果要从分子水平上进行区分，这 3 种方法都难以进行定量确定。可通过微卫星序列获得相应农村母鸡和农村土鸡蛋的微卫星序列进行分析鉴定，进而精确判断。本试验研究的 3 种鉴定方法适用于真假鸡蛋的鉴定，如果为真鸡蛋，用此 3 种方法为阳性结果，反之则为阴性结果，该研究可为更好地保护人们的健康和进一步落实食品质量安全市场准入制度提供技术保障。
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