摘 要
随着我国养蜂行业的快速发展，蜂产品产量已居世界领先地位，其质量和安全问题也逐渐成为了人们日益关注的焦点。在养蜂生产过程中，不合理用药及环境污染物迁移都极易导致蜂产品中出现药物残留，兽药残留污染是我国蜂产品面临的最主要安全问题之一。近年来，蜜蜂的病毒性疾病给蜂农造成了巨大的经济损失，然而已有的中药治疗方法和生物制剂技术效果并不显着，部分蜂农将抗病毒类兽药作为蜜蜂病毒性疾病的治疗手段，导致蜂蜜中抗病毒类药物残留蓄积。目前，国内外尚无关于蜂产品中抗病毒类药物多残留检测方法的研究和报道。本研究旨在开发与建立蜂蜜中抗病毒类药物的多残留检测方法，对我国多个地区的蜂蜜样品进行检测，探明抗病毒类药物在蜂蜜中的暴露水平，并进一步探究抗病毒类药物在蜂蜜不同加工和贮存条件下的残留消减规律。
本研究分为两个部分，第一部分开发了一种利用苯硼酸（Phenylboronic Acid;PBA）固相萃取柱分步骤收集五种抗病毒药物的前处理方法并结合液相色谱串联质谱技术（LC-MS/MS）建立了蜂蜜中利巴韦林、吗啉胍、金刚烷胺、金刚乙胺和美金刚的残留检测方法，方法中五种抗病毒药物的定量限依次为 5、0.5、0.5、0.2、0.2 ?g/kg，检测限为 2、0.2、0.2、0.1、0.1 ?g/kg。方法采用内标法定量，回收率范围在 82.46%~ 116.34%，日间日内精密度（RSD＜15%）显示该方法具有良好的重现性和稳定性。该方法成功应用于农业部蜂产品风险监测项目，并对来自全国 7 个省份（湖北，辽宁，吉林，黑龙江，陕西，河北，四川）的 563 个样品进行了检测，分析了我国抗病毒药物残留现状。在所有检测的蜂蜜样品中，抗病毒药物阳性检出率为 2.84％，而中蜂蜜和意蜂蜜中抗病毒药物的检出率分别为 1.38％和 3.35％。
第二部分探究了抗病毒类药物在蜂蜜中的残留消减规律，分为常温储存试验和高温加工试验两部分。不同温度下，五种抗病毒类药物的降解规律不同，利巴韦林、金刚烷胺、金刚乙胺和美金刚的降解速率相对缓慢，在 4℃，25℃和 60℃试验期间内均未观察到其半衰期。80℃条件下，利巴韦林、金刚烷胺和金刚乙胺的半衰期分别为 9、12 和 10 小时。吗啉胍降解速率最快，在 4℃和 25℃温度下，吗啉胍的半衰期分别在 165 天和 130 天左右。60℃下吗啉胍的半衰期在 22 小时左右，而 80℃下吗啉胍的半衰期仅为 2 小时。该项研究首次探明了蜂蜜中五种抗病毒药物在不同温度下的残留消减规律，为蜂农选择合适的抗病毒类药物治疗蜜蜂囊状幼虫病提供了数据支持，同时也为可能残留抗病毒药物的蜂蜜制定合适的加工和贮存条件提供了技术支持。
关键词： 蜂蜜；抗病毒药物；残留检测；液质联用；消减规律。
Abstract
With the rapid development of China's beekeeping industry, the production of bee products has taken the lead in the world, and its quality and safety issues have gradually become the focus of increasing attention. In the process of beekeeping, irrational use of drugs and migration of environmental pollutants can easily lead to the accumulation of drug residues in bee products. Veterinary drug residue pollution is one of the most important safety issue of bee products in China. In recent years, the viral diseases in bee colonies have caused huge economic losses to beekeepers. However, the effects of the existing Chinese medicine treatment methods are not significant, and the biological preparations are not yet mature. Therefore, some beekeepers try to use antiviral drugs as a treatment method for viral diseases which resulting in the accumulation of antivirals in honey. At present, there is no introduction of multi-residue detection methods for antiviral drugs in bee products around the world. The purpose of this study is to develop and establish a multi-residue detection method for antiviral drugs in honey and to test honey samples in various regions of China, to determine the exposure level of antiviral drugs in honey, and to further explore the drug reduction of antiviral residues under different processing and storage conditions in honey.
This research is pided into two parts. In the first part, a new pretreatment method was developed for distributed collection using PBA (Phenylboronic Acid) solid phase extraction column and combined with liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for the determination of ribavirin, moroxydine, amantadine, rimantadine and memantine in honey. The quantification limits (LOQ) of ribavirin, moroxydine,amantadine, rimantadine and memantine are 5, 0.5, 0.5, 0.2, 0.2 ?g/kg, and the detection limits (LOD) are 2, 0.2, 0.2, 0.1, 0.1 ?g/kg, respectively. Internal standard was used for quantification, the recovery range is between 82.46% to 116.34%. The day-to-day precision (RSD <15%) reflects the good reproducibility and stability of this method. This method was successfully applied to the bee products risk monitoring project of the Ministry of Agriculture in China, testing of 563 samples from 7 provinces (Hu Bei, Liao Ning, Ji Lin, Hei Long Jiang, Shan Xi, He Bei, Si Chuan) and the status of antiviral drugresidues in China was analyzed. Among all honey tested samples, the positive rate of antiviral was 2.84%, while the detection rates of antiviral drugs in apis cerana honey and apis mellifera honey were 1.38% and 3.35%, respectively.
The second part explores the law of residue reduction of antiviral drugs in honey, and is pided into two parts: normal temperature storage experiment and high temperature processing experiment. At different temperatures, the degradation law of the five antiviral drugs are different, ribavirin, amantadine, rimantadine and memantine degrade relatively slow and no half-life was observed during the test period at 4℃, 25℃ and 60℃. At 80℃,the half-lives of ribavirin, amantadine and rimantadine are 9, 12, and 10 hours,respectively. Among them, moroxydine degrades the fastest, the half-life of moroxydine was about 165 days and 130 days at 4℃ and 25℃, respectively. Furthermore, the half-life of moroxydine at 60℃ is about 22 hours while only 2 hours at 80℃. This study for the first time explored the law of residue reduction of five antivirals in honey at different temperatures, providing data support for beekeepers to select appropriate antiviral drugs for the treatment of bee cystic larval disease, it also provides technical support for the development of suitable processing and storage conditions for honey that may remain antiviral drugs.
Key words: Honey; Antiviral drugs; Residue detection; LC-MS/MS; Reduction law。
1 、绪论
1.1 、简介。
蜂产品主要包括蜂蜜、蜂王浆、蜂胶、蜂花粉等[1]。蜂蜜中富含丰富的碳水化合物、蛋白质、维生素、矿物质等营养成分，另外还富含各种酶以及免疫活性因子等[2]，是消费者信赖的营养滋补产品，具有满足人体所需营养物质以及提高免疫力、美容养颜等众多功效。我国是世界养蜂大国，蜂产品的产量居世界第一[3]，然而蜂蜜中的兽药残留问题是限制我国蜂产品行业健康发展的关键因素，蜂蜜中兽药残留来源主要有两方面，养蜂过程中一些蜂农在经济利益的驱动下，为预防蜜蜂疾病而使用违禁药物，又或在用药期仍然摇蜜或采浆，导致蜂产品中兽药残留超标；另一方面由于环境中的土壤和水分蓄积的抗菌药物也极易通过迁移的方式带入蜂蜜中导致产生药物残留。蜂蜜是我国重要的出口产品之一，随着全球经济一体化和食品贸易国际化，蜂蜜中的药物残留受到主要经济体如日本、欧盟以及美国等国家和地区的特别关注。世界各国纷纷制定相应的法律法规来限制药物的使用，药物残留测定技术也成为国内外设立技术壁垒的主要手段。因此，必须建立并不断优化蜂产品中兽药残留检测的方法，来确保我国蜂产品的质量安全。
1.2 、蜂蜜中兽药残留现状。
兽药残留是指用药后残留在畜禽体内或产品（如奶品、肉品、蜂蜜等）中的原型药物及其代谢产物[4]。兽药按用途可分为 3 大类，抗菌药、抗病毒药、和抗寄生虫药[5]。蜜蜂在产蜜期间，蜂群极易受到一些细菌、病毒和寄生虫的侵染，导致蜜蜂产蜜能力下降，进而给蜂农带来巨大经济损失。由于一些兽药价格低廉，且效果较好，因此，部分蜂农在经济利益的驱动下，不合理使用甚至滥用兽药来防治蜜蜂疾病，导致蜂产品中兽药残留蓄积，严重威胁消费者的健康。近几年来关于我国蜂蜜中兽药残留检出事件屡见不鲜。2002 年，我国出口欧盟的一批蜂产品中被检出氯霉素、链霉素残留超标，欧盟因此发布禁令，全面禁止进口中国蜂蜜，美国、加拿大、日本、沙特、等国家，相继提高了对中国蜂产品药物残留的检出限量要求，使我国蜂产品出口严重受阻[6]，直到 2004 年，欧盟对我国进口蜂蜜才开始解禁[7]；2006 年 2月，日本厚生省规定我国对日出口的蜂王浆中不得检出氯霉素；同年 5 月，日本开始执行“肯定列表制度”，将蜂产品的进口门槛提高到了几乎无法检测出的标准[8]；2007 年 8 月日本增加了进口蜂产品 13 项磺胺类检测，使我国蜂产品的出口形势更加严峻；2009 年至今，中国销往欧盟（比利时、英国、德国）的蜂蜜发生了多起因使用未经许可的红霉素、林可霉素和检出禁止使用的硝基呋喃代谢物被退回和就地销毁事件，造成了严重经济损失；2010 年，美国 FDA 宣称，在中国出口蜂产品中检出氯霉素[9]。
蜂农使用抗病毒药物并导致其残留蓄积的主要原因是中华蜜蜂囊状幼虫病（CSBD），CSBD 是我国蜜蜂常见的一种病毒性疾病，该病传播快，发病致死率高，尤其对蜜蜂幼虫影响极大，给我国蜂产品行业的发展带来了前所未有的挑战[10]。它是一种由蜜蜂囊状幼虫病毒（CSBV）引起的病毒性疾病，CSBV 是一种 RNA 病毒，常见于中华蜜蜂幼虫中，但是意蜂对该病毒有较强的抗性，发病率较小，无需任何治疗便可自愈。研究表明，温度和空气湿度等气候因素与 CSBD 的爆发密切相关。
此外，在蜜蜂繁殖季节，大量新生幼虫的出现也会提高感染风险，幼虫一旦被感染，它会迅速在个体中传播并造成大量死亡，这将严重影响数量和蜂群和蜂蜜的质量。
当前对 CSBD 的预防措施主要有改善饲养管理水平，培育抗性较强的蜂王，中药治疗和抗病毒药物治疗。近年来，已有报道使用中草药治疗 CSBD 的病例，但均未取得满意的效果[11]。因此，一些蜂农使用经济和有效的抗病毒药物来治疗 CSBD 以减少其经济损失，这也是蜂蜜样品中检出抗病毒类药物的主要原因。为此本研究开发了蜂蜜中抗病毒类药物的残留检测方法，但开发该类残留检测方法并不是最终的目的，技术的发展应该被用来服务于最终目标，即确保蜂产品行业的健康发展。加快建立健全相关食品安全问题的监测体系，规范生产企业合理使用农药和兽药，从源头上杜绝食品中兽药残留，改变我国当前蜂产品中抗病毒等各类药物残留的现状，这对提高蜂产品的质量和实现可持续发展具有重要的意义。
目前，世界各国并没有明确规定禁止在蜂产品行业中使用抗病毒类药物，但由于抗病毒类药物对人体具有一定的毒性作用，美国食品和药品监督管理局（FDA）明确规定了利巴韦林等抗病毒药物的使用对象[12]。因此，我们必须加快建立蜂产品中抗病毒类药物残留检测方法，走在抗病毒类药物残留检测领域的前列，健全我国蜂产品质量标准体系，加大蜂产品中的质量监控及农兽药以及其他有害物质检测检测，确保我国蜂产品的质量与安全已经变得刻不容缓。
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1.3、 抗病毒药物毒性
1.4、 畜禽产品中抗病毒药物的检测方法
1.4.1、 生物芯片法
1.4.2 、传感器法
1.4.3、 免疫分析法
1.4.4、 液相色谱串联质谱法
1.5 、研究目的和意义
1.6 、研究内容和方法
2 、蜂蜜中五种抗病毒药物检测方法的建立与实际应用.
2.1、 材料与方法
2.1.1、 试剂与材料
2.1.2、 主要仪器与设备
2.1.3 、仪器条件
2.1.4 、标准品配制
2.1.5、 样品前处理
2.1.6 、定量方法
2.1.7、 方法学验证
2.1.8、 实际样品检测与应用
2.2 、实验结果
2.2.1 、方法学验证
2.2.2、 实际样品检测结果与讨论
2.3 、结果与讨论
2.3.1 、样品前处理的优化
2.3.2、 仪器方法的优化
2.4 、小结
3、 抗病毒类药物在蜂蜜中的残留消减规律研究.
3.1、 研究背景
3.2 、材料与方法
3.2.1、 主要试剂与材料
3.2.2 、主要仪器与设备
3.2.3 、仪器条件.
3.2.4 、实验设计
3.2.5 、标准溶液配制
3.2.6 、样品前处理
3.2.7 、定量方法
3.3、 实验结果
3.3.1、 常温实验.
3.3.2、 高温实验.
3.4、 结果分析
3.5、 小结
4 、结论
4.1 、蜂蜜中五种抗病毒类药物检测方法的建立与实际应用。
用 1%甲酸水作为提取剂，然后采用 PBA 固相萃取柱净化，采用两步收集法即在不同的净化过程中收集目标分析物。然后使用 Agilent SB -AQ 色谱柱作为分离手段并结合优化后的洗脱梯度，成功实现了待测物与杂质间的色谱分离。方法学评价实 验显 示 该 方法 的 回 收 率 在 82.46%~116.34% 范 围 内 ，日 内和 日 间 精 密 度RSD<14.58%，反映了这种新开发的方法具有良好的稳定性和可信度。吗啉胍、利巴韦林、金刚烷胺、金刚乙胺和美金刚的定量限分别为 0.5、5、0.5、0.2 和 0.2 ?g/kg。
最后，该方法被成功应用于中国农业农村部蜂产品质量安全风险监控项目中，对来自全国 7 个省份（湖北，辽宁，吉林，黑龙江，陕西，河北，四川）的 563 个样品进行了检测，抗病毒阳性检出率 2.84％，而中蜂蜜和意蜂蜜中抗病毒药物的检出率分别为 1.38％和 3.35％。利巴韦林、吗啉胍、金刚烷胺、金刚乙胺和美金刚的检出浓度范围分别在 5.65 ?g/kg ~ 14.92 ?g/kg、0.29 ?g/kg ~ 28.26 ?g/kg、0.33 ?g/kg ~1.64 ?g/kg、19.55 ?g/kg、0.21 ?g/kg ~ 0.28 ?g/kg。
4.2 、蜂蜜中五种抗病毒类药物的残留消减规律。
通过观察 5 种分析物的浓度水平随时间的变化，评估了蜂蜜在常温 4℃和 25℃以及高温加工环境 60℃和 80℃下在蜂蜜中的稳定性。五种抗病毒药物中，吗啉胍降解速率最快，在 4℃、25℃、60℃和 80℃条件下的半衰期分别为 165 天、130 天、22小时和 2 小时。这一结果表明，在距离摇浆期之前一段时间，吗啉胍可以作为潜在药物来治疗蜂群中某些相关的病毒性疾病。
参考文献.
