气相色谱法来监控膝关节炎外敷贴剂中的有效成分

　　膝骨关节炎( Osteoarthritis) 是骨科最常见的疾病之一，以中、老年人群多发，其患病率仅次于缺血性心脏病而屈居第二。据流行病学初步调查显示，其在人群的患病率为 8. 3%，随着我国逐步进入老龄化社会，这一数字必将逐年增加〔1 －2〕。为缓解患者的痛苦，笔者课题组在本院协定处方的基础上，按照新药研发的程序，经过动物实验，研发了膝关节炎外敷贴剂，为了控制该贴剂质量，笔者参考了《中华人民共和国药典》，采用了气相色谱法来监控该贴剂中的有效成分( 挥发油) 。

　　1 仪器与用药

　　1. 1 仪器 GC － 14 型气相仪: 日本岛津公司;GAX － 2000 型空气发生器: 北京汇佳精仪器公司;GHL － 300 型氢气发生器: 北京汇佳精仪器公司;SK － 3200H 型超声清洗器: 上海科导仪器有限公司; AL204 型电子天平 梅特勒 － 托利多仪器( 上海)有限公司; SHB －3 型循环水多用真空泵: 郑州杜甫仪器厂。

　　1. 2 药品与试剂 冰片标准品: 上海雅吉生物制品有限公司( 批号 1202021) ; 水杨酸甲酯: 上海雅吉生物制品有限公司( 批号 1102033) ; 甲醇( 色谱纯) :Merck 公司( 批号 20090901) ; 乙醚、乙酸乙酯、冰醋酸、正丁醇、甲酸、氢氧化钾、三氟乙酸、亚硝酸钠等均为分析纯试剂; 膝关节炎外敷贴剂: 是由本院制剂室制，( 批 号 分 别 为 100702、100703、100804、100805、100806、100808) ; 阴性对照品，由本研究室自制。

　　1. 3 方法
　　1. 3. 1 色谱分析条件 PDI 检测器; 色谱柱: 聚乙二醇 －20M 为固定相; 流动相载气: 高纯氮气，毛细管柱; 进样口温度为 220℃，检测器温度为 250℃。

　　柱温采用程序升温，初始温度 90℃，保持 1 min，升温速度 6℃ /min，升至 120℃，再以 0. 4℃ /min 升温至 125℃，最后以 10℃ /min 升温至 230℃。流速: 25ml / min，进样量: 1 μl，定量方法: 内标法; 理论塔板≥15 000。

　　1. 3. 2 测试溶液的制备1. 3. 2. 1 内标溶液制备 取内标物水杨酸甲酯1 000. 0 mg，精密称定，置 25 ml 容量瓶中，加入70% 乙醇溶解，摇匀 ( 40. 00 mg / ml) ，作为内标溶液。气相图谱见图 1。【图1】

　　
　　1. 3. 2. 2 标准品溶液的制备 取冰片 202. 4 mg，精密称定，置25 ml 容量瓶中，加入70%乙醇溶解稀释至刻度，摇匀( 8. 096 mg/ml) ，作为标准品溶液。气相色谱见图 2。【图2】

　　
　　1. 3. 2. 3 标准品溶液加入内标溶液的制备 精密称取 1. 3. 2. 1 项下内标液 1 ml 于 10 ml 容量瓶中，加入 1. 3. 2. 2 项下标准品溶液 1 ml，70%乙醇定容，作为标准品内标溶液。气相色谱见图 3。【图3】

　　
　　1. 3. 2. 4 供试品溶液的制备 称取贴剂 20. 000 g，置 500 ml 圆底烧瓶中，加入蒸馏水 250 ml，加热至沸腾。圆底烧瓶上加入挥发油提取器收集挥发油。

　　将收集到的油水混合物用乙醚萃取，挥干乙醚，残渣用 70% 乙醇溶解，同时加入 1. 3. 2. 1 项下内标液 1ml，置于 10 ml 容量瓶中，用 70% 乙醇定容，备用。气相图谱见图 4。【图4】

　　
　　1. 3. 2. 5 阴性对照品溶液的制备 精密称取不含乌药、益智仁、石菖蒲药材的贴剂 10. 000 g，置于500 ml 圆底烧瓶中，加入蒸馏水 250 ml，加热至沸腾。圆底烧瓶上加入挥发油提取器收集挥发油。将收集到的油水混合物用乙醚萃取，挥干乙醚，残渣用70% 乙醇溶解后，置于 10 ml 容量瓶中，用 70% 乙醇定容，备用。气相图谱见图 5。【图5】

　　1. 3. 3 校正因子的测定 取标准品内标溶液，按照1. 3. 1 项下色谱条件进样，进样量 1 μl，得冰片峰面积为 23 238，内标峰面积为 1 915，校正因子计算如下〔3〕。【公式】

　　
　　其中，f : 校正因子; A 内: 内标峰面积; A 对: 冰片峰面积; C内: 内标液浓度; C对: 对照品浓度。1. 3. 4 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0、1. 2 ml，分别置 10 ml 容量瓶中，再分别精密量取的内标溶液 1 ml，用 70% 乙醇稀释至刻度，摇匀。分别吸取 1μl 注入气相色谱仪中，以对照品溶液的浓度为横坐标( 0. 161 9、0. 3238、0. 485 7、0. 564 1、0. 647 6、0. 809 6) ，对照品与内标峰峰面积的比值为纵坐标( 0. 075 52、0. 124 3、0. 172 4、0. 198 0、0. 220 5、0. 276 0) 进行线性回归。

　　得回归方程 y = 0. 307 1x + 0. 024 6，r = 0. 999 6，0. 161 9 ～ 0. 809 6 mg / ml 范围内线性关系良好。见图 6。【图6】

　　
　　1. 3. 5 精密度实验 精密称取冰片 110. 0 mg，置25 ml 容量瓶中，加入内标储备液 1 ml，加入 70% 乙醇溶解稀释至刻度，摇匀，按 1. 3. 1 项下色谱条件，重复进样 6 次，进行测定。计算冰片与内标物峰面积的比值，结果其相对标准偏差 ＲSD 为0. 13%( n =6) ，表明本试验条件精密度良好。结果见表 1。

　　1. 3. 6 重复性实验 精密称取同一批号贴剂 6 份，置1 000 ml 圆底烧瓶中，加入蒸馏水500 ml，连接挥发油测定器，自测定器上端加水使充满刻度部分，联接回流冷凝管。将烧瓶内容物加热至沸腾，并继续蒸馏保持微沸，保持冷凝管的中部呈冷却状( 无水滴) 。加热 3 h，停止加热，放置 15 min，将水放出，取出挥发油于 5 ml 容量瓶中用 70% 乙醇溶解稀释定容至刻度。0. 45 nm 微孔滤膜过滤。进样量为 1μl，计算峰面积。结果见表 2。

　　1. 3. 7 加样回收率实验 取 6 份已知含量的贴剂各 10 g，精密称量，置 1 000 ml 圆底烧瓶中，加入样品溶液( 精密称取冰片标准品 25. 23 mg 于 100 ml容量瓶中，获得0. 252 3 mg/ml 的样品溶液) 1 ml，加入蒸馏水 500 ml，连接挥发油测定器，按 1. 3. 2. 4 项下操作。结果见表 3。【表1-3】

　　
　　1. 3. 8 样品测定 分别取批号为 100702、100703、100804、100805、100806、100808 的贴剂 6 批样品，按1. 3. 2. 4 项下方法，制备制剂样品供试品溶液，用0. 45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品〔4〕。精密吸取 1 μl，手动进样 6 次，结果见表 4。【表4】

　　
　　2 结果与讨论

　　从上述实验结果可以看出，笔者建立的质量控制标准科学，可行。中医中药是我国的国粹，其理论博大精深，中药复方是一个极其复杂的体系，为了更好地控制该中药复方的质量，建立一套稳定、可靠、重复性好的质量控制标准是非常必要的。

　　结合膝关节炎外敷贴剂中的复方中药成分，尤其是挥发油成分，是该方中的主要药效成分，笔者建立了控制它的方法，就相当于控制了该药的质量，由于该药是复方成分，所以笔者将继续研究该药的其他成分的控制方法，以求更好的控制该药的质量。

　　参考文献
　　
　　〔1〕 李茂强，史晨辉 . 骨关节炎的实验研究现况与进展〔J〕. 农垦医学，2004，26( 1) : 29.
　　〔2〕 Arromdee E，Michet CJ，Crowson CS，et al. Epidemiology of gout:is theincidence rising〔J〕. J Ｒheumatoi，2006，29: 2403 － 2406.
　　〔3〕 李发美 . 分析化学〔M〕. 第 5 版 . 北京: 人民卫生出版社，2009: 413.
　　〔4〕 杜志谦，夏华玲 . 江海肖乌药挥发油化学成分的 GC － MS 分析〔J〕. 中草药，2003，4( 34) : 308 －309.