生长因子在肌腱损伤愈合的动物实验进展,骨伤科论文

　　肌腱损伤的发病率正逐年增高，究其原因主要与越来越多的中年人参与运动或者剧烈运动有关。以跟腱为例:跟腱断裂发病率为(6 ～ 37) /105［1］，75% 与体育运动有关，这还不包括跟腱的其它损伤。因为肌腱损伤后愈合缓慢，并且没有一种手术方案能使受损的肌腱恢复到正常的组织结构和机械强度，所以肌腱损伤在临床上仍是一个严重的并且悬而未决的问题［2］。近年来随着组织工程学和生物医学的新兴发展，一些生长因子在肌腱损伤愈合的动物实验中表现出诱人前景。常见易损伤的肌腱包括肩袖、指屈肌腱、髌腱和跟腱等，本文对肌腱的生理解剖、断裂的影响因素、一般治疗和生长因子在肌腱治疗中的进展综述如下。

　　1 肌腱的生理解剖特点

　　肌腱是由被称为“腱细胞”的成纤维细胞和丰富的胶原细胞外基质组成的纤维结缔组织，在肌肉和骨骼之间建立一种特殊的连接，通过将收缩力从肌肉传递到骨骼而使身体运动。肌腱的生理和病理特性主要依赖于机械刺激［3］。肌腱表现出较高的机械强度、良好的伸展性和一个最优水平的弹性来执行其独特作用。肌腱的拉伸强度与其直径和胶原含量有关，能承受 50 ～100 kg/cm2的重量［4］。肌腱是乏血管组织，基础代谢率低，其氧气和营养主要通过内部的肌－腱结和腱骨连接以及外部的腱旁组织和滑膜鞘供应。

　　2 影响肌腱损伤的因素

　　肌腱损伤病因复杂，多数学者认为与肌腱承受过度负荷或者过度使用有关，其确切病因尚不清楚。①运动创伤:运动中肌腱所承受的张力往往超过其生理负荷，导致肌腱在微观水平上的改变，反复的超生理张力或者强大且突然的暴力可导致肌腱的宏观改变，甚至断裂。肩袖、髌腱和跟腱的损伤与其密切相关。② 开放创伤:如切割伤、电锯伤、挤压伤等，主要与指屈肌腱断裂有关。③ 血液供应特点:肌腱多是乏血管组织，外伤导致的血供破坏以及其在解剖结构上存在乏血管区的固有弱点易使损伤的肌腱延迟愈合或者不愈合。跟腱表现最为突出。④ 药物:Carroll et al［5］认为，我们可能低估了对乙酰氨基酚对髌腱损伤的影响，尤其在老年人的髌腱损伤。另外，其它药物包括氟喹诺酮类抗生素、皮质激素、肝素等都显示与肌腱损伤有关。⑤ 其它:包括年龄、疾病［肺移植，系统性红斑狼疮(SLE)，慢性阻塞性肺疾病(COPD)］、遗传因素等。目前认为肌腱损伤是多因素影响［6］的结果，包括肌腱血供、损伤、增龄、一些疾病及某些药物、遗传因素等综合作用的结果.

　　3 肌腱损伤动物模型的建立

　　肌腱损伤动物模型一般采用导致肌腱损伤的因素来建立。目前用来研究肌腱损伤的动物模型主要采用机械刺激和药物诱导两种方法。

　　3． 1 机械刺激机械刺激包括被动刺激和主动刺激。一些学者采用被动刺激，如电刺激或者被动拉伸肌腱建模:早期研究［7］显示，使用较高的电刺激频率和未成年的动物更容易获得成功的动物模型，而进一步的研究表明电刺激的模型不能模拟肌腱的持续慢性损伤。Fung et al［8］通过手术暴露髌腱，固定髌骨和胫骨，然后用低于断裂负荷的负载直接循环作用于髌腱来建模。这个模型产生了类似于人类肌腱损伤的生物力学性能变化，可应用于研究积劳性损伤过程。另一些学者采用主动刺激，如跑台运动建模:Soslowsky et al［9］通过设置大鼠在 10°跑台上进行下坡跑，成功模拟了类似人类冈上肌的病理损伤过程，目前这一模型在探究肌腱损伤机制上得到广泛的应用。Glazebrook et al［10］通过设置大鼠在10°跑台上进行上坡跑而建立动物跟腱损伤模型，然而跑台运动存在重复性取样的缺陷，需要进一步的研究完善。

　　3． 2 药物诱导 ① 胶原酶:一些学者采用注射胶原酶建立动物模型［11］，获得的肌腱损伤类似人类肌腱损伤最后阶段的病理过程，目前已在指浅、趾深屈肌腱、跟腱和髌腱上广泛应用。② 前列腺素:Khanet al［12］在大鼠跟腱周围注射前列腺素 E2(PGE2)，产生以退行性变为主的肌腱损伤动物模型。③ 皮质类固醇:早期观点［13］认为皮质类固醇可以治疗肌腱损伤，而不正确、不合理的激素注射可引发肌腱损伤，因而皮质类固醇肌腱周围注射也可以用来建立肌腱损伤的动物模型。

　　3． 3 生长因子联合手术建模手术暴露肌腱并横断，或以生长因子涂层的缝线缝合，或肌腱断端涂抹生长因子后缝合，建立肌腱断裂的动物模型。目前这一模型已广泛应用于绵羊、白兔、大鼠等动物的肩袖损伤、髌腱断裂、前后交叉韧带断裂、跟腱断裂以及腱骨连接处的肌腱断裂的愈合研究中。

　　4 动物肌腱损伤的生长因子治疗进展

　　肌腱等软组织损伤的治疗，目前没有统一的方案。保守治疗恢复时间长，再断裂率高，愈合后残留不同程度的关节功能障碍;手术治疗术后并发症多，可能导致肌腱的延迟愈合或者不愈合。目前研究表明:生长因子联合手术治疗动物肌腱损伤，术后再断裂率低，恢复时间加快，术后生物力学功能良好，相关生长因子［14］起着关键的调控作用，如骨形态发生蛋白(BMP)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板源生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)、PGE2、富血小板血浆 (PＲP)、血管内皮生长因子(VEGF)和胰岛素样生长因子 1(IGF1)等。肌腱愈合是一个高度复杂的生物学过程，包括多种生长因子的精确协调。

　　4． 1 肩袖 Seeherman et al［15］通过研究证实:以胶原和透明质酸膏负载的重组人骨形态发生蛋白-12(rhBMP-12)在羊模型中能加速急性全层肩袖损伤的愈合，其最大负荷和硬度都得到证实。他还认为，这种加速愈合能使个体恢复期缩短并能更早地回到职业运动和一般业余活动中。Hee et al［16］也通过绵羊肩袖损伤模型证实:相比单一 500 μg PDGF-BB涂层的缝线修复，75 ～150 μg 的 rhPDGF-BB 并Ⅰ型胶原基质的缝线能改进肩袖的生物力学强度和组织结构外观，从而改善临床愈后。另外，Ｒeuther etal［17］通过大鼠肩袖损伤模型提示，肩袖损伤后的不同负荷可能导致关节疼痛和功能障碍等值得注意的损害。因此，了解涉及关节损伤的机械力学过程能为治疗肩袖损伤提供更好的帮助。

　　4． 2 指屈肌腱指屈肌腱损伤术后早期被动活动的原则对腱固有的愈合很重要，以确保良好的愈后。指屈肌腱损伤手术恢复后因粘连常伴有功能的损失，而唯一公认的预防粘连形成的方法是物理治疗。Farhat et al［18］的体外实验表明:TGF-β1 不仅证实在指屈肌腱损伤再生中有积极的作用，同时也确认了其在平衡细胞外基质(ECM)和基质金属蛋白酶(MMP)表达中倾向前者的不可避免的纤维化作用。Thomo-poulos et al［19］通过犬科动物指屈肌腱损伤模型研究发现，bFGF 尽管能加速指屈肌腱愈合的细胞分化阶段，并在早期促进指屈肌腱血管再生和炎症反应，但对恢复肌腱的机械性质和功能性质没有明显作用，反而导致腱周瘢痕形成和手指活动范围的减小，因而作者不推荐滑膜内指屈肌腱修复应用 bFGF。

　　4． 3 髌腱 Ferry et al［20］研究证实:虽然 4 周的小鼠髌腱腱鞘周围 PGE2注射被证实不是一个有效的腱病模型，但是另一方面发现，注射 PGE2后的髌腱的结构和物料性质都得以改善，因而表明在某些情况下，PGE2在髌腱重塑中有积极的作用。Ansorgeet al［21］也通过小鼠髌腱损伤模型证实: 分化抗原簇44(CD44)的缺失通过改变基因表达，能创造一个有利于修复再生的环境，显着改善髌腱的物料性质并减少交叉横断面，因而该研究表明 CD44 的限制在人髌腱损伤中可能促进修复模量。另外，Penteadoet al［22］通过兔髌腱模型证实，体外高能量超声波治疗髌腱损伤并不能导致血管再生的改变。

　　4． 4 跟腱 Cummings et al［23］通过大鼠跟腱横断模型证实:以 rhPDGF-BB 为涂层的可吸收缝线可明显促进跟腱的愈合及重塑，并能改善修复跟腱的生物力学性质。Park et al［24］研究证实:在家兔跟腱－骨连接处损伤的动物模型实验中，负载于纤维蛋白凝胶中的来自骨髓穿刺液的 PＲP 和 BMP-2 能加速腱骨愈合，并证实外科修复后的第 8 周 PＲP 和 BMP-2组的最大负荷显着高于对照组。Lee et al［25］学者的研究证实:体外以 BMP-12 的简单刺激足以诱导大鼠骨髓间充值干细胞分化为腱细胞，并且这种现象能在体内持续，这一研究将有益于腱修复重建和组织工程学的发展。

　　5 生长因子治疗肌腱损伤的机制

　　肌腱损伤愈合中，存在着由腱细胞分裂、增殖，修补肌腱断裂、缺损部位的内源性愈合和由腱外膜细胞增殖而参与的外源性愈合的双重愈合机制，生长因子起着关键的调控作用。

　　5． 1 BMP-12 BMP-12 不同于 BMP 家族中的其它成员，目前基本证实 BMP-12 植入体内能诱导腱和韧带样组织的形成，而没有骨组织的形成，是肌腱修复愈合的重要调节因子。① BMP-12 抑制肌腱术后粘连，其分子机制可能与腱基因标记物 Thbs4、Eya1、Eya2、Scx、Epha4 的表达有关，其调节 TGF-β1及 Smads 信号通路的表达，TGF-β 介导的愈合的一个重要特点［18］是替代原生细胞外基质蛋白的纤维化瘢痕，而是主要由纤维连接蛋白，Ⅰ型和Ⅲ型原胶原组成，最终起到抑制粘连的作用。② BMP-12 增强跟腱生物力学性质，其分子机制可能与 Scx 和Tnmd 的表达有关。最近研究显示: 在体外 ( 试管内)以 BMP-12 处理骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)能显着促进腱细胞谱系标记物 Scx 和 Tnmd 的表达，Scx 是腱祖细胞分化中第一个表达的转录调节因子，而 Tnmd 由成熟的腱细胞表达，并调节腱细胞的增殖和矩阵组织［25］。另外，机械力实际上通过活化的 TGF-β-/Smad2/3 中介的信号通路调节 Scx 的表达，而这正是维持腱特殊的细胞外基质所需要的［26］。③ BMP-12 促进胶原合成及塑形，其分子机制可能与腱基因标记物 Scx、Thbs4、Col1α1、Col1α2的表达有关，通过其信号通路 Smads 可以调节胶原的表达，尤其是Ⅰ型胶原的表达，并能增加基质胶原酶(MMP-1)的表达，降低胶原酶抑制剂(TIMP-1)的表达。④ BMP-12 加速跟腱愈合。Majewski et al［27］实验证实 BMP-12 c-DNA 基因转导的治疗在改善并加速跟腱愈合上充满前景，特别是影响早期组织再生，从而导致跟腱更快的恢复。BMP-12 加速跟腱愈合的具体机制目前仍不清楚。

　　5． 2 PDGF-BB PDGF-BB 同源二聚体在肌腱损伤后呈内源性表达，能够促进肌纤维母细胞产生胶原，尤其是 I 型及Ⅲ型胶原;能促进间叶细胞的趋化性和有丝分裂，重塑细胞外基质并改善修复肌腱的生物学特性，包括机械性能，胶原结构和血管分布［28］。进一步的研究显示［29］:PDGF-BB 联合Ⅰ型胶原基质治疗绵羊肩袖损伤模型，相比单纯 PDGF-BB 更能提高肩袖的生物力学强度和解剖外形。PDGF-BB 治疗肌腱损伤的机制可能是在转录水平上通过上调前胶原 mＲNA 而使胶原蛋白合成增加，还可能通过上调 TGF-β mＲNA 水平而间接促进肌腱愈合。然而，我们目前对其生理机制，包括基因表达，信号通路仍知之甚少。

　　5． 3 TGF-β 在肌腱损伤愈合中，TGF-β 介导愈合的一个重要特点是由Ⅰ、Ⅲ型原胶原和纤维连接蛋白替代原生细胞外基质蛋白的纤维化瘢痕，因而TGF-β 的表达上调导致肌腱愈合中的瘢痕形成。同时，人腱的病理与从细胞外基质释放的大量的活化的 TGF-β 有着直接的联系。但是，TGF-β 可以促进Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅻ 型胶原的表达，增强跟腱的生物力学性能。因而 TGF-β 在肌腱损伤愈合中的作用是双向的，可能的机制是:下调 TGF-β-/Smad2/3 mＲNA，减少瘢痕形成;高度上调 Scleraxis［30］和 Mohawk 的表达，启动并加速肌腱愈合;在 ECM 的生成中平衡相关基因的表达，完成肌腱重建塑形等。

　　5． 4 bFGF 在肌腱缝合的最早阶段，bFGF 促进新生血管形成和炎症反应;还能加速肌腱愈合中的细胞增殖期。然而 Thomopoulos et al［19］关于滑膜内屈肌腱损伤的动物模型研究中，bFGF 虽然能促进细胞分化增殖，但未能改善屈肌腱的功能和结构性质。

　　进一步研究［31］显示，bFGF 未能改善屈肌腱的功能和结构性质的机制可能是其下调Ⅰ、Ⅲ型原胶原mＲNA 的表达; 另一方面，bFGF 能上调基因 lubri-cin、HAS2、MMP-1 和 MMP-13 等的表达，间接促进跟腱愈合过程中的增殖分化。而最近有研究［32］显示:bFGF 为加速早期肌腱愈合过程及预防肌腱术后粘连提供了新的思路，只是在调控 bFGF 浓度等方面尚无定论。所以，bFGF 可能与其它生长因子联合应用治疗跟腱损伤。

　　5． 5 其它传统的观点认为 PGE2注射可导致肌腱的退行性变。然而 Ferry et al［20］的研究否认了这一点，认为 PGE2在肌腱损伤重建塑形中起到重要积极作用，其机制可能与 PGE2产生的 COX 及其代谢物花生四烯酸有关。PＲP 包含许多生长因子，包括 PDGF、IGF、TGF-β1、EGF，有研究显示，PＲP 能促进肌腱干/祖细胞的增殖和胶原蛋白的表达，最近有报道［33］称，接种 PＲP 的 BMSC 能显着加强愈合跟腱的最大断裂力和刚度，从而改善跟腱的生物力学性质，其相关机制仍不清楚。

　　6 展望

　　如何最大程度的恢复受损的肌腱到无限接近正常的结构完整性和机械强度仍然是尚待解决的问题，骨组织工程学为我们提供了许多可以借鉴的方法，并在动物肌腱损伤模型研究中取得了治疗效果，但在人肌腱治疗中的安全性和实用性仍待临床证实，人肌腱损伤的治疗从基础研究到改善的治疗方法的转变是一个必不可少的过程。

　　参考文献:

　　［1］Suchak A A，Bostick G，Ｒejd D，et al． The incidence of Achillestendon ruptures in Edmonton［J］． Foot Ankle Int，2005，26(11):932 － 936．

　　［2］Sakabe T，Sakai T． Musculoskeletal diseases-tendon［J］． Br MedBull，2011，99(1):211 － 225．

　　［3］Zhang G，Young B B，Ezura Y，et al． Development of tendonstructure and function:regulation of collagen fibrillogenesis［J］． JMusculoskelet Neuronal Interact，2005，5(1):5 － 21．

　　［4］Sharma P，Maffulli N． The future:rehabilitation，gene therapy，optimization of healing［J］． Foot Ankle Clin，2005，10(2):383 －397．

　　［5］Carroll C C，Dickinson J M，LeMoine J K，et al． Influence of ac-etaminophen and ibuprofen on in vivo patellar tendon adaptations toknee extensor resistance exercise in older adults［J］． J Appl Physi-ol，2011，111(2):508 － 515．

　　［6］Blanco I，Krhenbühl S，Schlienger Ｒ G，et al． Corticosteroid-as-sociated tendinopathies:an analysis of the published literature andspontaneous pharmacovigilance data［J］． Drug Saf，2005，28(7):633 － 643．

　　［7］Archambault J M，Hart D A，Herzog W．Ｒesponse of rabbit A-chilles tendon to chronic repetitive loading［J］． Connect TissueＲes，2001，42(1):13 － 23．

　　［8］Fung D T，Wang V M，Andarawis-Puri N，et al． Early responseto tendon fatigue damage accumulation in a novel in vivo model［J］． J Biomech，2010，43(2): 274 －279．［9］ Soslowsky L J，Thomopoulos S，Tun S，et al． Neer Award 1999．Overuse activity injures the supraspinatus tendon in an animalmodel: a histologic and biomechanical study［J］． J Shoulder El-bow Surg，2000，9(2): 79 －84．

　　［10］ Glazebrook M A，Wright J Ｒ，Langman M，et al． Histological a-nalysis of Achilles tendons in an overuse rat model［J］． J OrthopＲes，2008，26(6): 840 －846.