神经坏死病毒在患病赤点石斑鱼稚鱼组织中分布

　　病毒性疾病严重危害我国水产养殖业的健康发展, 近年来我国学者报道了不少新生病毒性疾病, 其中病毒性神经坏死症(Viral nervous ne-crosis virus, VNN)是一种在世界范围内流行的鱼类疾病。VNN 流行在中国、日本、澳大利亚、英国、加拿大、挪威等国家, 可造成 30 多种重要经济鱼类的大规模死亡, 严重危害着鱼类养殖业, 因此该病毒是国际水产病害研究的热点。神经坏死病毒分类上属于野田病毒科(Nodaviridae), 乙型野田病毒属(Betanodavirus)。病毒粒子直径约 30—40 nm, 二十面体, 无囊膜, 由衣壳和两条正单链 RNA 基因组RNA1 和 RNA2 组成。其中 RNA1 编码病毒 RNA聚合酶和非结构蛋白 B2。RNA2 编码病毒唯一的衣壳蛋白。在光学显微镜下, 患病鱼类在脑部和视网膜有明显空泡, 故又称病毒性脑膜炎和视网膜病。

　　在透射电镜下可观察到患病鱼脑、视网膜细胞质中存在大量病毒粒子。

　　神经坏死病毒严重危害我国经济鱼类, 特别是石斑鱼的养殖。2001 年中国率先报道了赤点石斑鱼Epinephelus akaara 病毒性神经坏死症, 随后开展组织病理、流行病学、衣壳蛋白的克隆和表达、全基因组测定等研究。我国其他学者也做大量研究, 主要包括病理学, RT-PCR 检测方法、全基因组测定、流行病学、免疫保护、致病性、新细胞株建立、基因干扰载体等。地高辛杂交和免疫荧光检测技术可分别检测病毒核酸和蛋白在患病组织中的分布, 为病毒的感染和复制提供重要信息。至今为止国内还缺乏此类基础资料。我们团队曾建立地高辛标记 DNA探针原位杂交技术; 本文采用地高辛标记 DNA探针和 NNV 衣壳蛋白特异性抗体, 研究 NNV 核酸和蛋白在患病赤点石斑鱼稚鱼组织中分布, 探讨了此病毒的感染途径和复制位点, 为防治此病提供基础资料。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验材料

　　赤点石斑稚鱼为广东省大亚湾水产试验中心所生产, 全长 0.3—0.5 cm, 孵化后 20d—30d。患病鱼苗体弯曲、体色较黑、身体失衡、浮于水面、间或螺旋状游动, 为典型病毒性神经坏死病症状(图 1)。

　　用赤点石斑神经坏死病毒特异性引物对稚鱼脑部总RNA 做 RT-PCR 检测, 患病鱼样品呈阳性, 健康鱼样品呈阴性。
　　
　　1.2 组织切片

　　用 10%中性福尔马林固定稚鱼。鱼苗先经透蜡固定, 然后在 70%的酒精中处理 2h, 80%酒精中 2h,90%酒精中 2h, 95%酒精中 1h, 100%酒精中 1h, 100%酒精中 3 次每次 0.5h, 酒精和二甲苯比例为 3︰1 溶液中 0.5h, 纯二甲苯中 2 次每次 0.5h, 58℃石蜡中透蜡 2h, 然后将样品和石蜡置于冰上, 降温凝固。将透蜡固定后的组织进行切片, 厚度为 0.4—0.5 μm,自然风干。

　　1.3 PCR 引物名称和序列

　　根据神经坏死病毒衣壳蛋白基因序列(NC008041.1)设计三条引物: F1 (5′-GGATTTGGACGTGCGACCAA-3′), R3 (5′-CGAGTCAACACGGGTGAAGA-3′), F2 (5′-CGTGTCAGTCATGTGTCGCT-3′)。其中 F1 和 R3 用于扩增 RNA2 编码衣壳蛋白的 T2 片段(875 bp), F2 和 R3 用于扩增 RNA2 编码衣壳蛋白的 T4 片段(426 bp)。T2 片段的 3′和 T4 片段完全重叠。

　　1.4 地高辛探针制备

　　取患病鱼苗的头部(包括眼睛), 用 TRIZOL (LifeTechnologies) RNA 抽提试剂盒, 按照使用说明进行RNA 抽提。用 F2-R3 引物合成 T4 片段来制备地高辛探针。先将提纯的 RNA 在沸水中煮 5min, 然后置于冰上 5min。取 1 μL 上述 RNA, 加入事先配制好的逆转录反应液中, 每一反应液含有(5×Firststrand buffer 2 μL, 0.1 mol/L DDT 1 μL, 2.5 mmol/LdNTP mixture 4 μL, R3 引物(20 pmol) 0.5 μL, 核酸酶抑制剂(Life Technologies) 0.1 μL, SUPERSCRIPTTMⅡ逆转录酶(Life Technologies) 0.2 μL, 焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的蒸馏水 1.2 μL), 在 42℃中反应30min, 99℃中 10min 灭活逆转录酶。将上述逆转录反应产物稀释 70 倍, 采用 Boehringer Mannheim 公司生产的地高辛试剂盒(DIG DNA Labeling andDetection Kit )生产探针。PCR 反应液: vial3 buffer 5μL, vial2 buffer 5 μL,引物 F2 (20 pmol)0.5 μL, 引物 R3 (20pmol) 0.5 μL, vial1(聚合酶)0.75 μL, 稀释的逆转录产物 5 μL, 加蒸馏水到 50 μL, 先 95 ℃,2min, 然后 30 个循环, 循环条件为 95 ℃ , 10s; 60 ℃,30s; 72 ℃ , 3min;最后在 72℃ 延长 7min, 4℃ 中10min。反应产物在 1.5%琼脂糖胶中电泳, 溴化乙锭染色, 照相记录结果。

　　1.5 地高辛探针特异性检测

　　采用神经坏死病毒衣壳蛋白基因引物 F1 和 R3 扩增 T2 片段(875 bp), F2 和 R3 扩增 T4 片段(426 bp)。

　　用地高辛标记探针对上述产物进行杂交, 以确认其特异性。取神经坏死病毒特异性扩增 PCR 片段 T2和 T4, 在 2%琼脂糖胶中 120 V 电泳 1h。对电泳胶用蒸馏水泡洗 3 次, 每次 30s。在摇床上(50 r/min)将电泳胶置于变性液中处理 30min, 再用蒸馏水浸泡 3 次, 每次 30s。在中性缓冲液中浸泡 15min, 然后用湿法将 DNA 片段转移到尼龙膜。随后用 2×SSC浸泡 10min, 在 80℃中处理 2h。将尼龙膜浸泡于9.5 mL 预杂交液中 68 ℃ , 1h。将地高辛探针在沸水中热变性 10min, 置于冰上 5min, 取 2 μL 探针加到1 mL 杂交液中, 充分混合。将尼龙膜浸泡于含有探针的杂交液中, 密封避光 68℃杂交 6h。随后用2×SSC, 0.1% SDS (w/v) 25 mL 洗 2 次, 每次 5min。

　　用 0.1×SSC, 0.1%SDS (w/v) 20 mL 洗 2 次, 每次15min。将尼龙膜置于空气中干燥。用地高辛核酸检测试剂盒进行检测如下。用 Buffer I (1 mol/LTris·HCl, 1.5 mol/L NaCl, pH 7.5), 0.3% Tween20(w/v) 洗 1min, 然后用 25 mL Buffer II (0.5% 阻断剂溶解于 Buffer I 中)洗 30min, 用 5 mL Buffer2 按 1︰5000 的比例稀释 vial3(抗地高辛耦联抗体), 在室温中培育 30min。然后用 15 mL Buffer1 洗 2 次, 每次15min, 用 5 mL Buffer III (0.1 mol/L Tris·HCl,1.5 mol/L NaCl, pH 9.5, MgCl250 mmol/L)浸泡2min。在新鲜配制的显色液 2.5 mL 处理 12h, 然后用 10 mL Buffer IV (100 mmol/L Tris·HCl, 10 mmol/LEDTA, pH8.0), 洗 5min, 显色、照相记录结果。

　　1.6 组织切片的地高辛检测

　　切片先在 60℃中烘 45min, 然后进行脱蜡和复水: 在纯二甲苯中处理 2 次, 每次 10min; 50%二甲苯、50% 酒精混合液中处理 5min; 依次在 100%和95% 乙醇中各处理 2 次, 每次 2min; 在 80%、70%和 50% 酒精中各处理一次, 每次 3min, 最后在蒸馏水中复水 3min。用蛋白酶 K 在 37℃中消化 2min,用 0.4%甲醛固定 5min。将地高辛探针在沸水中热变性 10min, 立即置于冰上 5min, 然后混合在 1 mL 杂交液中。将杂交液加到切片上, 密封避光于 42℃杂交 12h 。 漂 洗 与 显 色 : 在 2×SSC 溶 液 [0.05%N-lauroylsarcosine (w/v), 0.01 % SDS (w/v), 0.4%封闭液]中 37℃处理 2 次, 每次 5min; 1×SSC 溶液中37℃处理 2 次, 每次 5min; 0.5×SSC 溶液中 37℃处理 2 次, 每次 5min; 0.1×SSC 溶液中 37℃处理 2 次,每次 5min, Buffer I 中 25℃处理 5min; Buffer II 中37℃处理 15min; 在 37℃中, 用地高辛耦联抗体培育 1h(Buffer II 按 1︰3000 倍稀释抗体); 在 25℃用Buffer I 洗 2 次, 每次 5min; 用 Buffer III 在 25℃中洗 5min; 用 Buffer III 稀释 NBT/BCIP 显色液(浓度为 20 μL/mL), 在 25℃中避光杂交过夜。随后在Buffer IV 中 25℃ 洗 15min; 蒸馏水洗 3min, 封片。用光学显微镜观察结果, 拍照。

　　1.7 免疫荧光检测

　　切片先在纯二甲苯中处理 2 次, 每次 5min; 然后依次在 100%、90% 和 70% 酒精中各处理 2min,最后在蒸馏水中复水 2 次, 每次 1min。用 1×PBS(137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 m mol/LNa2HPO4, 1.8 mmol/L KH2PO4, pH 7.4)洗 3 次, 每次5min; 用 0.1%的蛋白酶 K 在 37℃中处理 10min, 用0.4%甲醛固定 5min, 用 1×PBS 洗 3 次, 每次 5min,用兔抗拟 鲹神经坏死病毒衣壳蛋白血清(日本森广一郎博士惠赠)1︰100 稀释, 在 37℃孵育 30min, 用1× PBS 洗 3 次, 每次 5min。用山羊抗兔 Ig G 耦联FITC 血清抗体(1︰36), 在 37℃中孵育 30min, 用1×PBS 洗 3 次, 每次 5min, 用 60% 封片专用甘油进行封片, 荧光显微镜观察, 拍片。

　　2 结果

　　2.1 探针的制备和特异性检测

　　采用 RT-PCR 法, 扩增病毒衣壳蛋白 T4 片段。

　　因为反应中用 DIG-dUTP 代替 TTP 来制备地高辛探针, DIG-dUTP 分子量比 TTP 大, 因此地高辛探针的分子量也比 T4 (426 bp)大(图 2a)。为了检验探针的特异性, 对病毒衣壳蛋白 T2 和 T4 两段 DNA 进行杂交。结果表明探针和 2 个片段都有杂交。从图中可以看出, 虽然 PCR 条带 T2 在溴化乙锭染色的信号强于 T4 (图 2b), 但是地高辛信号 T4 强于 T2(图2c), 这是因为地高辛探针序列和 T4 完全一致, 和T2 只有 49%的同源。另外, DNA 标准分子没有和探针杂交, 这些结果表明地高辛探针具有很高的特异性(图 2 c)。

　　2.2 组织切片的地高辛检测

　　根据碱基互补配对原则, 标记有 DIG 的 DNA片段可以和病毒基因组 RNA2 杂交。因此地高辛探针可以检测病毒在体内的复制、转录状况。杂交阳性显色为黄色到紫褐色, 颜色越深, 病毒 RNA 含量越高。根据图 3 结果, 患病石斑鱼稚鱼的脑部、脊髓、视网膜和鳃上皮细胞内可以观察黄色到紫褐色,其中以脑部和视网膜内层脉络膜细胞颜色最深, 甚至连成一片。在肝细胞内也可观察分散的褐色颗粒,但是在肠道中几乎没有检测到阳性信号。作为阴性对照, 健康石斑鱼稚鱼相应的组织没有明显的黄褐色, 图3f显示阴性对照视网膜的检测结果。因此, 病毒主要在脑部、视网膜和鳃上皮细胞内复制或转录。

　　2.3 免疫荧光法检测

　　免疫荧光的第一抗体为兔抗神经坏死病毒衣壳蛋白血清, 因此其检测信号代表病毒衣壳蛋白在组织中的分布。衣壳蛋白可以来自病毒粒子, 也可以来自没有组装成病毒粒子的蛋白。阳性反应呈绿色荧光, 衣壳蛋白越多, 绿色荧光越强。图 4 表示, 患病石斑鱼稚鱼的脑部、脊髓、视网膜和鳃上皮细胞内可以观察到强绿色荧光, 在肝细胞内只是较弱荧光, 在肠道几乎没有检测到阳性信号。作为阴性对照, 健康石斑鱼稚鱼相应的组织没有明显的绿色荧光, 图4G显示阴性对照视网膜的检测结果。因此, 病毒粒子主要分布在感染稚鱼的脑部、视网膜和鳃上皮细胞内, 或者在这些器官内进行病毒蛋白的翻译。

　　3 讨论

　　本文采用地高辛探针和免疫荧光法分别检测病毒核酸和衣壳蛋白在感染稚鱼中的分布。两种检测方法检测到病毒在感染稚鱼体内的分布一致。病毒核酸和衣壳蛋白在脑、脊髓、视网膜、鳃上都有大量的分布, 肝脏中有少量分布, 在肠道组织中几乎没有分布。虽然病毒在肝脏中有少量分布, 但是其分布是分散点状, 没有连成一片, 而且并不导致肝脏细胞的空泡化坏死。为什么病毒感染只导致神经和视网膜的空泡化坏死, 其机理还不清楚, 需要进一步探索。Chi 等采用地高辛探针对石斑鱼苗进行组织分布检测, 结果表明, 脑、视网膜、鳃、肝、肠和心脏的血细胞中均有分布, 并认为鳃和肠道可能是病毒的入侵途径。根据本实验的结果, 肠道中几乎没有检测到病毒的核酸和衣壳蛋白信号, 因此肠道是否为传播途径, 值得探讨。鳃上皮可以检测到强的阳性信号, 有理由认为鳃是病毒的主要感染途径。当然, 本文的研究结果也不能排除还有其他的传播途径, 比如通过皮肤等, 这需要进一步研究。

　　有趣的是, Chi 等采用 RT-PCR 法血检测到病毒存在于石斑鱼幼鱼的血液中, 并认为病毒在体内可以通过血液传播到其他器官, 在疾病的发生上具有重要意义。由于稚鱼的血液采集比较困难, 本文无法提供这方面的信息, 需要进一步探讨。

　　神经坏死病毒的感染途径和复制研究是重要的基础信息。各国学者对病毒的聚合酶、衣壳蛋白、B2 蛋白的功能进行了研究, 为病毒的致病机理提供了基础资料。此外, 最近研究认为病毒可以存在于受精卵的卵膜内, 碘试剂只能消毒受精卵表面, 无法彻底切断病毒的垂直传播。因此, 对于神经坏死病毒的有效防治还需要更多的研究积累。【图略】