利用沼液培养钝顶螺旋藻的试验,渔业论文

　　螺旋藻( Spirulina) 是一种古老的微藻类生物，含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素和生物活性物质，对提高生物体免疫力、防治多种疾病有显着辅助作用．此外，螺旋藻作为饲料添加剂可以促进动物生长发育并提高动物产品的外观和营养价值．螺旋藻生长繁殖快，光合效率高，养殖成本低、效益好，近年来国内外规模养殖较多．传统的螺旋藻规模养殖中需要向水中人工投加小苏打和氮磷等营养盐，由于上述营养盐价格贵且用量大，导致螺旋藻的生产成本较高，其中培养基成本一般占总生产成本的20% ～30%．
　　
　　饲料级螺旋藻的价格很高，导致虽然饲料级螺旋藻的需求空间很大，但实际产量很小．沼液中含有丰富的氮、磷、钾等营养元素以及锌、镁等微量元素，同时还含有蛋白质、氨基酸、糖类、吲哚乙酸、核糖等营养物质和维生素、生长激素等生长调控物质．利用沼液培养钝顶螺旋藻( Spirulina platensis) ，不仅可以实现沼液的脱氮除磷深度处理，创造环境效益; 还可以降低螺旋藻的培养成本，收获藻体作为饲料，解决市场上饲料级螺旋藻供应不足的难题，创造经济效益．沼液培养螺旋藻的室内小规模试验已有很多文献报道，如Caizares 等用猪粪悬液好氧发酵后的废水培养螺旋藻，藻干粉中蛋白含量为 36%．李玉宝等在添加 10% Zarrouk 培养基的沼液中培养螺旋藻，最终产率约为 7. 5 g·( m2·d)－ 1，粗蛋白含量 30% ～40% ．
　　
　　Chung 等在室内螺旋藻光照培养塘内缓慢注入 10% 的厌氧发酵后的猪粪废水，并添加NaHCO3等无机营养盐，螺旋藻的产率可达 5g·( m2·d)－ 1，藻粉粗蛋白含量 55% ～61%．沼液的室内养殖中螺旋藻的产率低或者蛋白含量低．此外，室外小规模的养殖试验也有少量报道．吴开国等把沼液上清液用砂滤池过滤后用漂白粉消毒，添加海盐、K2HPO4、FeSO4、MnCl2、NaHCO3，在室外 20 m2养殖池中连续培养 2 周得到粗蛋白含量62. 3% ± 1. 1% 的螺旋藻，产率为 7. 4 g·( m2·d)－ 1．Chaiklahan 等用稀释 5 倍的 UASB 处理后的养猪废水，再添加 4. 5 g·L－ 1小苏打和 0. 2 g·L－ 1氮磷复合肥后，在 100 L 的室外开放式跑道池中培养钝顶螺旋藻，螺旋藻的产率为12 g·( m2·d)－ 1．沼液的室外养殖中添加较多的营养盐增加了养殖成本，而且受污染的风险较大，尚不能应用于规模化的养殖中．与纯培养相比，螺旋藻在废水中的培养普遍存在生长慢、产量低、性状不良、粗蛋白含量不高等问题．
　　
　　本研究从沼液中分离出了生长速率快、产量和蛋白含量高、适应性和抗逆性强、藻丝性状优良的钝顶螺旋藻株 ZJWST-S1．前期的室内跑道池试验已经证明 ZJWST-S1 能在沼液中快速增长，净产率可达 64. 7 g·( m2·d)－ 1，且螺旋藻的质量满足饲料级螺旋藻标准 GB/T 17243-1998．本研究在室外 40 m2椭圆形跑道池中，利用沼液培养本地分离的螺旋藻株 ZJWST-S1，探讨了螺旋藻的生长情况以及沼液中氮磷的去除情况，计算了沼液中氮磷向螺旋藻体的转化效率，并结合小试研究，分析总结了使用沼液室外规模化养殖螺旋藻过程中可能存在的问题和对策，以期为沼液的规模化养殖饲料级螺旋藻提供参考．
　　
　　1 材料与方法

　　1. 1 材料及方法

　　钝顶螺旋藻 ZJWST-S1 由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心( CGMCC) 保存，在光照恒温培养箱中用液体 Zarrouk的培养基在温度 25℃ ±2℃ 、光照6 000 lx ± 2 000 lx、光暗比( 12 h∶ 12 h) 条件下培养至 D560为 3. 0 ～5. 0 时接种．养藻用椭圆形跑道池( 图 1) 长 10. 0 m，宽 4. 0m，水深 0. 3 m． 2 个叶轮白天连续搅拌 8 ～ 10 h．跑道池使用前用 10%石灰水消毒．沼液取自嘉兴某规模化养猪厂沼液储存池，添加 40 mg·L－ 1聚合氯化铝，搅拌 0. 5 h 后静置沉淀，取上清液用清水稀释，使氨氮浓度小于 100mg·L－ 1，然后添加1 000 g小苏打调节水质初始 pH大于 8. 0．添加1 000 g NaCl 调节盐度，因第 1 批养殖中发现枝角类( 节肢动物门) 的污染，所以第 2 批开始添加 120 g 无水硫酸钙抑制枝角类的生长; 因第 3 批养殖中发现桡足类( 节肢动物门) 的污染，所以第 6 批培养中还添加了1 500 g EDTA，以抑制桡足类( 节肢动物门) 的生长． 2012 年 6 ～9 月在椭圆形跑道池中共养殖 6 批螺旋藻．向配制好的沼液培养基中接入对数期的螺旋藻种，使初始 D560不小于 0. 05．每隔 24 h 观察螺旋藻的生长状况，并记录养殖过程中天气、大棚内气温和养殖池中的水温、pH 和 D560的变化．
　　
　　培养 8 ～11d( 以实际情况而定) 后用 400 目滤布将螺旋藻从培养液中分离出来，滤液用双层定性滤纸过滤后测量水质，计算沼液中氮磷去除率，并评价其向藻体细胞的转化效率．为考察氨氮对螺旋藻生长的影响，配合室外中试试验进行了室内小试摇瓶试验，方法如下: 250mL 锥形瓶中装入 100 mL Zarrouk 培养基，加硫酸铵使培养基中氨氮浓度分别为 20、40、60、100、150、200 mg·L－ 1，接入藻种使 D560为0. 20，然后将锥形瓶置于光照恒温培养箱中连续培养 10 d，培养条件与藻种培育条件相同．每天手动摇匀 3 次，每 24 h 测定 D560．中试所用小苏打和 NaCl 为工业级，其余试剂均为优级纯．
　　
　　1. 2 分析测试方法

　　D560采用 722s 可见分光光度计在 560 nm 下测定; 螺旋藻干重测定时先把一定容积的藻液用400 目滤布过滤，之后在 60℃ 下烘 4 h，计算单位体积藻液烘干后的干重; 螺旋藻的产率由螺旋藻干重与 D560拟合相关曲线: Y( g·L－ 1) = 0. 239 4D －0. 000 1( Ｒ2＞ 0. 97) 换算获得; 常规水质分析参照文献．螺旋藻细胞中的氮磷含量根据文献提出的螺旋藻分子式进行估算: 螺旋藻分子式近似为 C106H263O110N16P，其中 C、N、P 所占百分比分别为 35. 8%、6. 3%、0. 87%．按照式( 1) 计算得到藻体中 N、P 含量:藻体中的 N( P) = 螺旋藻干物质积累量 × 藻体中 N( P) 的百分比 ( 1)按照式( 2) 、( 3) 计算得出沼液中去除的 N、P向藻体细胞的转化率:N 转化率 = 螺旋藻干物质积累量 × 6. 3% / 水中N 削减量 ( 2)P 转化率 = 螺旋藻干物质积累量 × 0. 87% / 水中 P 削减量 ( 3)
　　
　　2 结果与讨论
　　
　　2. 1 螺旋藻的生长过程曲线及产率计算

　　2012 年 6 ～ 9 月在椭圆形跑道池中共养殖了 6批螺旋藻，每批次的培养周期为 8 ～12 d，生长曲线如图 2 所示．第 1 批培养中，螺旋藻经过短暂的停滞期后进入对数生长期，第 7 d 发现水蚤终止培养，螺旋藻的产率为 13. 7 g·( m2·d)－ 1．第 2 和第 4 批培养中，螺旋藻的停滞期长且生长缓慢．第 3 批培养中，螺旋藻经过 4 d 的停滞期后进入对数生长期，第 9 d 螺旋藻浓度不再增加，并发现有水蚤污染，螺旋藻的产率为 5. 7 g·( m2·d)－ 1．第 5 批培养中，螺旋藻停滞期长且生长缓慢，第 7 d 浓度开始下降，而后养殖池中发现摇蚊幼虫繁殖．第 6 批培养中，螺旋藻经过 3 d 停滞期后能进入对数生长期; 但养殖池中显微镜观察发现有大量的虫卵( 图 3) ，第 7 d时养殖池中发现大量摇蚊幼虫并终止培养，螺旋藻的产率为 8. 0 g·( m2·d)－ 1．由于螺旋藻浓度较低时采收成本会很高，通常认为 D 为 0. 6 ～1. 0 时适合采收．本研究以 D560＞ 0. 8 作为采收基准．则 6 批培养中只有第 1、3、6批在培养途中或最终能够达到采收要求，而其余 3批螺旋藻生长缓慢，最终未能达到采收要求．第 1批养殖中螺旋藻生长快、停滞期短，在本研究的 6批次培养中产率最高; 相比之下，第 3 批和第 6 批养殖试验虽然达到采收浓度，但产率要低出很多，这与病虫害和停滞期较长等因素有关．上述 3 批次试验得到的螺旋藻产率只有前期小试产率的 1/5 ～1 /10，但是最高产率还是高于文献［5，7，9］报道的产率，而且本试验只添加了较少的营养盐，养殖成本更低．
　　
　　2. 2 沼液中的氮磷去除率及其向藻体细胞转化情况

　　各批次螺旋藻采收前后沼液中各水质变化如表1 所示．达到采收要求的 3 批次试验，采收螺旋藻后的沼液中氨氮、总氮、总磷、COD 的去除率分别为30. 4% ～ 48. 5% 、 41. 8% ～ 48. 6% 、 14. 3% ～94. 5% 、28. 6% ～ 48. 5% ．第 2、4、5 批因生长缓慢螺旋藻的浓度没有达到采收基准，在此不讨论其水质情况．本研究中氨氮、TN 和 TP 去除率较文献［18］报道值偏低，这主要是由于本研究养殖螺旋藻的沼液中氨氮、TN 和 TP 初始浓度相对较高．同时发现本研究中去除的 TN 中大部分是氨氮，这是因为藻细胞利用氨氮的方式主要是谷氨酰胺合成酶系统，有氨氮时首先利用氨氮; 没有氨氮时，硝酸盐或者亚硝酸盐会被硝酸还原酶或亚硝酸盐还原酶还原成氨氮，然后再被藻类吸收利用．
　　
　　此外，本研究中COD 也得到了少量的去除，这可能与螺旋藻体表面对有机物的吸附有关，也可能与螺旋藻具有一定的异养能力，可利用沼液中的有机物进行异养生长有关．表 1 中同时计算了沼液中去除的氮磷向螺旋藻体中的转化率．成功采收的 3 批次试验中螺旋藻细胞对 TN 和 TP 的同化量分别为 11. 8 ～23. 6 mg·L－ 1和 1. 6 ～ 3. 2 mg·L－ 1．氮磷的转化效率分别为12. 1% ～ 98. 5% 和 21. 2% ～ 83. 7% ．第 2、4、5 批因生长缓慢螺旋藻的浓度没有达到采收基准，不做讨论．第 1 批试验的氮磷转化率超过 80%，且氮磷转化率与生长速率呈正相关．然而仍有少量氮磷被去除了，但并未转化到藻细胞中去，这可能与藻体表面的吸附作用有关，也可能是受螺旋藻养殖池中其他微生物生长代谢的影响．此外，第 3、6 批的氮磷转化率均小于 50%，一方面可能是幼虫吞噬了一部分的螺旋藻使氮磷元素在虫体内累积; 另一方面高浓度的氨氮在养殖池中碱性环境( 约 8. 5 ～ 9. 5)和连续搅拌等因素的影响下以游离氨的形式挥发到空气中，而磷酸盐则可能与沼液中钙、镁反应生成沉淀被去除．
　　
　　2. 3 螺旋藻生长缓慢原因分析

　　本试验中，第 1 批养殖中螺旋藻停滞期短、生长速率快、产率高．与第1 批养殖相比，其余各批养殖中螺旋藻的停滞期较长，生长速率也较慢．文献表明，螺旋藻的生长受温度、光照、pH、营养盐等因素的影响． 6 ～9 月的水温在 20 ～30℃ 之间不会抑制螺旋藻的生长; 第 1 ～ 5 批养殖期间多为阴雨天气，光照的差异并不明显( 第 6 批养殖期间多为晴天，可能强光照是导致其停滞期长的原因之一) ; 各批次的初始 pH 在 8. 0 ～ 8. 5 之间，相差不大; 因此各批次生长差异主要不是由温度、光照、pH 引起的，而是由于沼液中不同浓度的营养盐导致的．与第 1 批养殖相比较，其余各批次沼液中可能导致螺旋藻停滞期长和生长缓慢的因素主要是COD、氨氮．已有研究表明光照条件下螺旋藻还可以利用少量糖类、有机酸、氨基酸等进行混和营养生长，但是高浓度的有机物会抑制螺旋藻的生长．第3、4、5 批养殖中 COD 均超过70 mg·L－ 1，可能抑制了螺旋藻的生长．与 COD 类似，高浓度氨氮同样会抑制螺旋藻的生长． Yuan 等研究表明，在高温、高 pH 时氨氮主要以游离氨的形式存在，游离氨对藻类有很大的毒性，因此高氨氮会抑制螺旋藻的生长．
　　
　　第 1 批养殖中氨氮的浓度为 43 mg·L－ 1，没有抑制螺旋藻的生长，而其余各批的氨氮浓度均超过第 1 批养殖．孙玉焕等研究表明螺旋藻在硫酸铵浓度小于0. 4 g·L－ 1( 85 mg·L－ 1) 时，螺旋藻能够正常生长;当硫酸铵添加量超过 0. 5 g·L－ 1( 106 mg·L－ 1) 时螺旋藻生长受到抑制． Converti 等在分批培养和连续流加培养中发现氨氮的最佳浓度为 1. 7mmol·L－ 1( 24 mg·L－ 1) ，在 10 mmol·L－ 1( 140mg·L－ 1) 时对螺旋藻有明显的毒害．为了确定本地藻种氨氮的耐受浓度和其余各批养殖中氨氮浓度是否是抑制螺旋藻生长的主要因素，在室内进行了氨氮耐受试验．不同氨氮浓度下螺旋藻的生长曲线如图 4，在氨氮浓度小于 60mg·L－ 1时，螺旋藻的生长无显着差异( P ＞0. 05) ，氨氮浓度超过 100 mg·L－ 1时，随着氨氮浓度的增加抑制越明显．因此，氨氮浓度小于60 mg·L－ 1时本地藻种能够正常生长; 本地藻种的氨氮耐受浓度为 150mg·L－ 1，超过 200 mg·L－ 1时有毒害作用．因此 3、4、5 批养殖中氨氮约在 100 mg·L－ 1，会抑制螺旋藻的生长．除了 COD、氨氮抑制作用外，本试验中停滞期长、生长缓慢和虫灾，考虑还可能是与藻种的接种浓度与活性有关．
　　
　　文献［30］表明，使用对数期的藻种并提高接种比例有利于缩短停滞期并提高产量，第 2 批养殖中使用稳定期藻种，且接种比例小于 1∶20，是导致其生长缓慢的主要因素．稳定期藻种活性差，导致停滞期延长，接种浓度低会增加受污染的风险．邹万生研究表明当接种比例为 1∶ 5时螺旋藻生长最快; 在室外规模化螺旋藻养殖中，一般的接种比例大约在 1∶ 3 ～1∶ 5之间．此外，本研究使用 Zarrouk 培养基进行育种，也就是说育种培养基与养殖池用的沼液培养基有明显的区别．培养基的突然转换可能是造成养殖池中停滞期长的另外一个重要因素．有研究表明，当接入到新的培养基中时，微生物需要时间合成新的酶．因此在今后的藻种培养时，采用逐步添加沼液的扩培方式来缩短螺旋藻的停滞期有可能是一种可行的方法．
　　
　　2. 4 病虫害的发生原因及控制方法

　　病虫害是影响本研究成功的最重要因素． 6 次试验中，发生了4 次病虫害．其中，第1、3 批养殖中发现了水蚤( 枝角类和桡足类) 污染，第 5、6 批养殖则有血虫( 摇蚊幼虫) 暴发( 图 5) ．螺旋藻的露天纯培养过程中，最常见的病虫害来自轮虫、水蝇和杂藻，来自水蚤和血虫污染也有报道．本研究中发生的病虫害与轮虫等关系不大，主要来自水蚤和血虫．这考虑是由沼液带来的虫卵．养猪废水经中温发酵，不能完全杀死全部的虫卵; 且沼液已经在沼液池里储存了较长时间，也可能有新的虫卵产生． Marcus 等研究表明桡足类的休眠卵具有极强的抗性，在严寒干燥环境中保存 20 个月，仍有 80% 的虫卵保持活性．崔福义等认为摇蚊幼虫能在高浓度废水中生存且虫卵有较强的抗性．养殖池中温度适宜，光照充足，易于虫卵的萌发，幼虫以螺旋藻为食能够快速繁殖．大棚养殖能够减少来自养殖池周围环境中的污染，但本试验中的虫卵主要来自于沼液，因前处理过于简单不能去除其中的虫卵．潘忠诚等研究表明利用膜过滤对白斑综合症病毒有良好的截留作用，因此今后有必要使用膜对沼液进行过滤处理，去除沼液中的虫卵后再用于螺旋藻养殖．
　　
　　3 结论

　　使用沼液在室外中试跑道池中培养螺旋藻，6批试验中有 3 批达到了采收浓度．螺旋藻产率接近既有文献报道的小试和中试产率，但是较使用同一藻种的前期室内跑道池小试结果明显降低．达到采收浓度的 3 批养殖中螺旋藻细胞对沼液中的氮磷有大量吸收，但受养殖条件和虫害影响，氮磷的转化效率还较低．本实试养殖虽然没能够长期稳定的运行，但获得了室外沼液养殖螺旋藻的宝贵经验，为规模化的沼液养殖奠定了基础．
　　
　　参考文献:

　　［1］陈金娥．螺旋藻的开发与应用［J］．食品研究与开发，2007，28( 9) : 154-157．
　　［2］ Holman B W B，Malau-Aduli A E O． Spirulina as a livestocksupplement and animal feed［J］． Journal of Animal Physiologyand Animal Nutrition，2013，97( 4) : 615-623．
　　［3］袁晓雄，杨淑培．螺旋藻的养殖与加工［M］．北京: 中国农业科技出版社，1997． 34-35．
　　［4］夏旗．钝顶螺旋藻对沼液的处理与利用［D］．重庆: 西南大学，2011． 3-4．