中华绒螯蟹幼蟹对Leu和Ile的需要量研究

　　亮氨酸(Leu)和异亮氨酸(Ile)是水产动物体内不能合成而必须从饲粮中获取的氨基酸, 即必需氨基酸(EAA), 都属于脂肪族氨基酸, 同时也都是支链氨基酸(BCAA)。它们特殊的结构和功能在生命代谢中占有特别重要的地位。亮氨酸是 BCAA 中唯一的生酮氨基酸, 刺激胰岛细胞释放胰岛素, 和缬氨酸、异亮氨酸一起可以起到保护肌肉的作用。亮氨酸的主要氧化部位在肌肉, 是合成机体蛋白质的原料, 可以抑制蛋白降解和促进肌肉蛋白合成;对血红蛋白合成和维持血糖水平以及激素的增加有重要作用; 亮氨酸的缺乏可能引起严重的缺乏症状如生长的阻滞。而异亮氨酸是合成动物体激素和酶类的原料, 具有促进蛋白质合成和抑制其分解的作用。目前, 国内外学者已经开展了一些水产动物对 Leu 和 Ile 营养需求的研究, 确定了虱目鱼(Chanos chanos Forsskal)、 斑 节 对 虾 (Penaeusmonodon)、印度鲮(Cirrhinus mrigala)、草鱼(Ce-nopharyngodon idellus)、建鲤(Cyprinus carpio var.Jian)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)等多种鱼虾的亮氨酸和异亮氨酸需求量。

　　中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis), 俗称河蟹、大闸蟹, 属节肢动物门甲壳纲, 是我国特有的淡水珍品。

　　目前, 关于中华绒螯蟹对氨基酸需求的研究仅限于赖氨酸、蛋氨酸和精氨酸。本试验以中华绒螯蟹幼蟹为研究对象, 以幼蟹的生长性能及肌肉必需氨基酸含量等为评价指标, 研究饲料中不同水平的Leu 或 Ile 对中华绒螯蟹生长的影响, 旨在获得中华绒螯蟹幼蟹对 Leu 和 Ile 的需要量, 以期完善中华绒螯蟹对十种必需氨基酸需要量的数据库, 为研制中华绒螯蟹营养平衡的人工配合饲料提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验用蟹

　　试验蟹苗购自上海市崇明岛长江口中华绒螯蟹养殖基地, 采用经过沉淀、过滤后的天然池塘水进行养殖。水泥池中暂养一周, 挑取体重均一、附肢完整的幼蟹作为试验对象。采用底面为长方形(60 cm×85 cm, 水容量 300 L)的白色塑料水箱, 箱内水深约30 cm, 每箱 40 只幼蟹, 初始体重为(0.90±0.02) g, 水箱内放置足够数量的网片及圆形 PVC 管作为隐蔽物。

　　1.2 试验饲料

　　采用单因子试验设计方法, 为了使基础饲料中目标氨基酸(Leu 或 Ile)含量尽可能低, 因此分别采用不同的饲料配方, 以酪蛋白、明胶、鱼粉为蛋白源, 糊精、玉米淀粉为糖源, 鱼油、豆油、卵磷脂为脂肪源制成基础饲料。基础饲料配方和营养组成见表 1, 氨基酸组成模式参照王树英和陈辉测定的河蟹肌肉氨基酸含量(表 2)。每个试验分别设 6 个氨基酸浓度梯度, 每个浓度 3 重复。饲料中 Leu 添加梯度为 0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%, 实测各组饲料 Leu 含量为 0.87%、1.26%、1.64%、2.03%、2.39%和 2.81%; 饲料中 Ile 添加梯度为 0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和 2.5 %, 实测各组饲料 Ile 含量为 0.69%、1.21%、1.70%、2.19%、2.70%和 3.21% (表 3)。

　　在试验饲料制作时, 先将原料粉碎, 使原料粉末能全部通过 60 目试验筛, 再按比例充分混匀后加适量水搅拌, 通过绞肉机挤成直径 1.5 mm 的长条,风干后, 破碎成粒径为(1—2) mm 的破碎料, 置于4℃冰箱内密封保存备用。
　　
　　1.3 饲养管理

　　采用表观饱食投喂法, 每天于上午八点和下午五点投喂两次, 次日吸污并补充养殖用水。此外, 每周定期测定水质情况, 水温(28—32)℃、溶解氧>5 mg/L、氨氮<0.1mg /L、pH 6.8—7.2, 连续充气增氧, 实验周期 60d。

　　1.4 样品采集与分析

　　试验期间, 河蟹因脱壳或相互残杀死亡后及时捞出, 并精确称重, 其增重部分不计入试验结果。试验结束后, 停食 24h, 捞出全部河蟹, 尽量沥干水分,称重。一部分烘干后作全蟹样品, 用于常规生化分析; 一部分提取肌肉样品, 滤纸吸干水分后用于氨基酸含量的测定。测定指标包括水分、粗蛋白质、粗脂肪、灰分以及氨基酸含量, 分别采用 105℃恒重法、凯式定氮法、索氏抽提法、550℃马福炉灼烧法以及氨基酸自动分析仪。

　　计算公式: 特定生长率(SGR, %/d)＝(Ln 结束时平均体重–Ln 开始时平均体重) /试验天数×100; 成活率(SR, %)=实验结束后试验蟹数目/实验开始时试验蟹数目×100。

　　1.5 数据分析

　　试验数据采用平均值±标准差(Mean±SD)表示,采用 SPSS 20.0 软件包对所得数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA), 若有显着差异, 再做Duncan’s 多 重 比 较 , 检 验 组 间 差 异 的 显 着 性(P<0.05)。
　　
　　2 结果

　　2.1 不同氨基酸水平对中华绒螯蟹幼蟹生长性能的影响

　　饲料亮氨酸水平对中华绒螯蟹幼蟹末均重和特定生长率有显着影响(P<0.05), 但对成活率影响不显着(P>0.05) (表 4)。河蟹的末均重和特定生长率随饲料中亮氨酸含量的升高呈先上升后下降的趋势。

　　当饲料中亮氨酸含量为 2.39% (Leu-5 组)时, 河蟹幼蟹的末均重和特定生长率均达到最大值, 与 Leu-4和 Leu-6组差异不显着(P>0.05), 但显着高于 Leu-1、Leu-2 和 Leu-3 组(P<0.05)。

　　饲料中异亮氨酸水平对中华绒螯蟹幼蟹末均重和特定生长率均有显着影响(P<0.05), 对成活率影响不显着(P>0.05) (表 5)。幼蟹的末均重和特定生长率随饲料中异亮氨酸含量的升高呈先上升后下降的趋势。当饲料中异亮氨酸含量为 2.19% (Ile-4 组)时,末均重和特定生长率均达到最大值, 显着高于Ile-1、Ile-2、Ile-3 和 Ile-6 组(P<0.05)。

　　2.2 中华绒螯蟹幼蟹对亮氨酸和异亮氨酸的需要量

　　以氨基酸水平(x)为横坐标, 特定生长率(y)为纵坐标, 根据折线模型得出中华绒螯蟹幼蟹饲料中亮氨酸最适需要量为 2.36% (图 1), 占蛋白含量的5.88%; 饲料中异亮氨酸最适需要量为 2.25% (图 2),占蛋白含量的 5.72%。
　　
　　2.3 亮氨酸水平对中华绒螯蟹幼蟹体组成的影响

　　由表 6 可知, 饲料中亮氨酸水平对中华绒螯蟹全蟹水分、粗脂肪和灰分没有显着影响(P>0.05)。粗蛋白含量随着饲料中亮氨酸水平的增加呈现先上升后下降的趋势, 当饲料中亮氨酸含量为 2.39%(Leu-5 组)时, 河蟹粗蛋白含量达到最大值 12.49%。

　　2.4 异亮氨酸水平对中华绒螯蟹幼蟹体组成的影响

　　由表7可知, 饲料中异亮氨酸水平对中华绒螯蟹全蟹水分、粗脂肪和灰分没有显着性差异(P>0.05)。

　　粗蛋白含量随着饲料中异亮氨酸水平的增加呈现先上升后下降的趋势, 当饲料中异亮氨酸含量为 2.19%(Ile-4 组)时, 河蟹粗蛋白含量达到最大值 12.43%。

　　2.5 亮氨酸水平对中华绒螯蟹幼蟹肌肉氨基酸组成的影响

　　由表 8 可知, 亮氨酸水平对河蟹肌肉谷氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、脯氨酸以及必需氨基酸总量(∑EAA)、非必需氨基酸总量(∑NEAA)、氨基酸总量(TAA)有显着性影响(P<0.05), 对其他氨基酸影响不显着(P>0.05)。当饲料中亮氨酸含量大于 2.39% (Leu-5 和 Leu-6 组)时,河蟹肌肉中的 Leu 含量、必需氨基酸总量和氨基酸总量均显着高于其他各试验组(P<0.05)。

　　2.6 异亮氨酸水平对中华绒螯蟹幼蟹肌肉氨基酸组成的影响

　　由表 9 可知, 异亮氨酸水平对河蟹肌肉谷氨酸、缬氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、脯氨酸以及∑EAA、∑NEAA、TAA有显着影响(P<0.05),对其他氨基酸无显着影响(P>0.05)。河蟹肌肉中的Ile 含量、必需氨基酸总量和氨基酸总量随饲料中异亮氨酸含量的增加呈现先升高后降低的趋势, 最大值均出现在 Ile-5 组(2.70% Ile), 但 Ile-5 组与 Ile-4组(2.19% Ile)差异不显着(P>0.05)。3 讨论亮氨酸是甲壳动物的必需氨基酸之一, 与异亮氨酸和缬氨酸被称为 BCAA。Leu 是合成机体蛋白质的原料, 具有许多重要的生物学功能。在本试验中, 饲料 Leu 含量不足时, 河蟹表现出显着的生长抑制, 随着饲料中 Leu 水平逐渐增加, 河蟹幼蟹的生长性能明显得到改善。这说明 Leu 可以为幼蟹的生长提供营养, 中华绒螯蟹能够利用晶体 Leu。以SGR 为评价指标, 通过折线模型得到中华绒螯蟹对Leu 的需要量为 2.36%的饲料干物质, 即占饲料蛋白的 5.88%。此需要量高于以往报道的甲壳动物对Leu 的营养需求(占饲料蛋白百分比), 如斑节对虾4.3%、凡纳滨对虾 5.71%、日本对虾(Marsu-penaeus japonicus) 3.4%和南美白对虾(Penaeusvannamei) 5.45%。与其他水生动物相比, 高于南亚野鲮(Labeo rohita) (3.75—3.92)%、建鲤 3.7%、大西洋鲑(Salmo salar) 5.2%、大菱鲆(Psetta maxima)4.6%、白鲟(Acipenser transmontanus) 4.3%、印度鲮 3.9%、鲈鱼(Lateolabrax japonicus) 5.67%等的亮氨酸需要量; 低于虹鳟(Oncorhynchus mykiss)9.2%、团头鲂(Megalobrama amblycephala) 6.98%和大黄鱼(Pseudosciaena crocea) 6.79%的研究结果。这说明不同种类的动物对亮氨酸需要量的差异较大, 可能与实验对象、个体大小、饲养管理、实验条件以及饲料组成和适口性等有关。另外, 本试验使用的是晶体氨基酸, 溶出问题也可能会对试验结果产生影响。这些影响因素有待进一步研究完善。

　　适宜的 Leu水平能够提高中华绒螯蟹幼蟹生长,随着饲料中 Leu 水平的升高, 河蟹幼蟹 SGR 和全蟹粗蛋白质含量均呈现先上升后下降的趋势。当饲料中 Leu 的含量为 2.39% (Leu-5 组)时, SGR 和机体粗蛋白含量达最大值, 但 Leu-5 组与 Leu-6 组的 SGR和机体粗蛋白质含量差异不显着, 说明过多的 Leu并没有明显限制河蟹幼蟹生长, 这与之前的研究结果略有不同, 或者饲料中 Leu 水平还可以继续增加, 说明河蟹幼蟹对 Leu 的需要量较高。

　　异亮氨酸属于脂肪族中性氨基酸, 也是生物体必需氨基酸之一, 与结构类似的亮氨酸、缬氨酸在营养上有相关性, 因其特殊的结构和功能, 在生命代谢中占有特别重要的地位。目前有关甲壳动物对异亮氨酸需要量的研究较少, 只确定了斑节对虾和南美白对虾对Ile的需要量分别为 2.7%和4.33% (占饲料蛋白百分比)。本试验通过折线回归模型得到中华绒螯蟹对Ile的需要量为2.25%的饲料干物质, 即占饲料蛋白的5.72%。由此可见不同种类甲壳动物对Ile的需要量存在较大差异。而且, 鉴于相关研究文献极少, 实验结果有待进一步证实。

　　另外, 3种支链氨基酸之间的拮抗作用也会影响某种支链氨基酸的需求量, 但这种拮抗作用在甲壳动物中还未见阐明。在本试验中, 饲料氨基酸组成模式是参照中华绒螯蟹肌肉氨基酸模式设计而得,使其满足除实验氨基酸外其他两种氨基酸的需求,以期减小因支链氨基酸间的拮抗对实验氨基酸需求量结果的影响。通过检测中华绒螯蟹肌肉氨基酸的组成, 发现饲料中亮氨酸或异亮氨酸的含量对肌肉中三种支链氨基酸的含量具有显着影响, 而且与全蟹粗蛋白的变化趋势极其相似, 均呈先增加后降低的趋势。但是满足需求后, 饲料中实验氨基酸水平对肌肉中三种支链氨基酸含量的影响也随之减小。

　　有报道也认为, 当饲料中其他支链氨基酸含量满足其最低需求时, 其拮抗作用对实验氨基酸需求量结果的影响较小。此外, 亮氨酸对全蟹蛋白和肌肉TAA测定结果表明, Leu需求满足后, 继续升高饲料Leu水平对蛋白质合成无影响。Garlick研究发现, 高浓度的亮氨酸对除骨骼肌以外的机体组织蛋白质的降解有抑制作用。因此, 当Leu水平升高时并未对蛋白质的合成和降解产生显着影响。而在异亮氨酸实验中, 饲料中Ile水平过高(Ile-6)时, 全蟹蛋白和肌肉TAA显着下降, 说明过量的Ile可能导致蛋白质合成代谢下降, 分解代谢增强, 从而抑制蛋白质沉积及幼蟹生长。

　　综上所述, 根据特定生长率和饲料氨基酸水平进行折线回归模型, 得到中华绒螯蟹幼蟹对亮氨酸的最适需要量为饲料干物质的 2.36% (占饲料蛋白5.88%), 异亮氨酸的最适需要量为饲料干物质的2.25% (占饲料蛋白 5.72%)。【表略】