液氨预处理后玉米秸秆的酶解效果研究

　　纤维素乙醇被称为第二代生物燃料技术，它以木质纤维素类生物质为原料，而农作物秸秆是该类生物质的重要来源之一。 我国年产秸秆 6.98 亿 t,其中玉米秸秆 1.71 亿 t,约占秸秆总量的 1/4[1],目前秸秆的利用率偏低。 预处理、酶解、发酵是纤维素乙醇炼制过程中的 3 个关键技术环节，预处理是克服木质纤维素原料的酶解顽抗性的必要手段[2-3]. 预处理方法主要有：酸法、碱法、水热法、蒸汽爆破法和氨纤维爆破法等[4-5]. 预处理效果通过酶解率、预处理成本、是否产生毒害酶解或发酵的抑制剂、环境危害等因素来判断。 我国学者围绕纤维素乙醇研究对玉米秸秆采用了酸法[6]、碱法[7]、水热法、汽爆法[8]、微波与酸化汽爆[9]等多种预处理方式，进行了预处理和酶解的相关试验研究，纤维素与半纤维素的 72 h 酶解率分别在 80%和 60%左右。 国外学者围绕玉米秸秆的预处理与酶解糖化的研究更为细致而全面[4-5],并重视预处理过程中的物理化学变化、木质素移除与转化等促进酶解的机理方面的研究[10-12].

　　对比预处理研究文献，以氨为介质的预处理方法对于玉米秸秆具有较好的预处理效果。 氨是一种价格低廉的碱性原料，其水溶液或纯液氨可用于预处理。 氨水预处理主要代表方法是氨回收渗滤法（ammonia recycle percolation,ARP），又可根据处理温度、氨含量与水分不同，细分为 ARP 法[13]、SAA 法（soaking in aqueous ammonia）[14]和 LMAA 法（low-moisture anhydrous ammonia）[15]等，但它的处理周期长，如 ARP 法长达 10~60 d. 液氨主要用于氨爆法或氨纤维膨胀法（ammonia fiber expansion,AFEX），处理后的玉米秸秆在添加纤维素酶 15 FPU/（g 葡聚 糖）时 168 h 的葡 聚糖和木聚糖的酶解率达到 95%和 80%以上[16],酶解效果非常好。

　　本研究在 AFEX 的基础上提出了 LAT 法，采用液氨加温处理，预处理温度范围加大，但不采用快速释放氨气的爆破法。 AFEX 过程基本上不产生酶解与发酵抑制剂和环境危害物[16],本实验与之相近。 因此对 LAT 预处理后玉米秸秆的酶解效果与酸、碱、热水、汽爆、AFEX 等预处理方法进行了对比。

　　1 实验材料与方法

　　1.1 材料

　　玉米秸秆（糯玉米）采自福建省三明市（东经 117.35°、北纬 26.13°），采收期为 7 月份（播种至青穗采收约 65 d）。 实验采用地上部分的整株植物，将其切割成约 1~2 cm 长条状，初晒后经 40 ℃烘干至含水率低于 15%,用 FZ102 微型植物粉碎机粉碎成 50~100 目粉末。 经混合均匀后采用水分分析仪 MA35（赛多利斯）测得其含水率，并用塑料袋密封后置-20 ℃冰箱中存放备用。

　　用于高效液相色谱（HPLC）分析的对照品的葡萄糖、木糖等均采购自 Sigma-Aldrich 公司，纯度为 99%以上；预处理用的氨采购自杭州龙山化工有限公司。

　　添加的水解酶为纤维素酶 （novozyme NS50013）、β-葡萄糖苷酶 （novozyme NS50010）， 由诺维信（中国）有限公司提供。 NS50013 纤维素酶的活性由滤纸法测定 ,它是一种混合酶，具有木聚糖酶活性，故实验中未添加木聚糖酶。

　　1.2 方法

　　实验分析方法参照了美国国家可再生能源实验室（National Renewable Energy Laboratory,NREL）制定的实验规程（Laboratory Analytical Procedure,LAP）[17],并减 少了酶制剂的添加量 （由 60 FPU/（g葡聚糖）改为 15 FPU/（g 葡聚糖）），加大了反应容量（由原规程中的 10 mL 增加为 15 mL）。

　　1.2.1 组分测定玉米秸秆中碳水化合物和酸不溶性木质素（Klason 木质素）采用酸水解法测定，碳水化合物组分由 LAP002 方法测定，酸不溶性木质素由 LAP003 方法测定。 LAP002 和 LAP003 采用二步酸解法，在一次实验中完成。

　　酸水解的具体步骤是先用分析天平称量已知含水率并去除抽提物的秸秆原料约 0.3 g, 加入72%硫酸 3 mL,在 30 ℃水浴中保持 2 h,加去离子水 84 mL（稀释至 4%硫酸），放入灭菌锅中 121 ℃保持 1 h.经真空过滤后将滤纸上的固形物烘干至恒重，用 HPLC 法（色谱分析柱采用 BioRad 醇酸柱HPX-87H）测定各种单糖的含量，并折算成葡聚糖（纤维素）、木聚糖、阿拉伯聚糖等比例，由滤纸上的固形物质量与灰分测定来确定不溶性木质素含量。

　　灰分测定采用 LAP005 规程，用分析天平称量 1 g 左右已知含水率的原料，将其放入已测定质量的有盖陶瓷坩锅中，置入箱式电阻炉中程序缓慢升温，约 2 h 后升至 575 ℃，保持此温度 4 h 以上。 冷至 105 ℃时将坩锅取出放入干燥器，冷却后称量质量并计算灰分。

　　1.2.2 液氨预处理（LAT 法）LAT 法预处理：根据原料确定反应用量，将确定量的液氨注入移液钢瓶 （300 mL），并 加热小钢瓶至 50 ℃左右；将待处理的已知含水率的原料放置在反应器（改装的高压反应釜，大连自控设备厂）中，并将反应器抽成真空；然后将氨注入反应器，加热反应器到预定温度；在预定温度下驻留一定的时间，而后氨被释放（约 30 s），即预处理过程完成。 取出处理原料置于通风柜中让处理后原料中的氨逸出，然后在烘箱中低于 40 ℃干燥。 称重并测得含水率，计算预处理后生物质原料得率，将处理后的原料放入-20 ℃冰箱冷藏备用。

　　LAT 预处理优化的工艺参数选择分别为：预处理的温度、含水率、驻留时间等 ,另外氨用量也可以作为参数供优化。

　　1.2.3 酶水解酶水解参照 LAP009 的相关规程进行，酶解液总量为 15 mL,每组样品酶解至少做一组重复。 根据规程，酶解采用 1%葡聚糖当量，即称取 0.15 g 葡聚糖当量的秸秆放入酶解瓶（20 mL 样品瓶），依次加入蒸馏水、柠檬酸钠缓冲溶液（平衡后 pH 值为 4.8）、抗生素（四环素和环己酰亚胺），经预混合1h 后添加纤维素酶、β-葡萄糖苷酶。 每克葡聚糖当量的生物质原料中添加纤维素酶 15 FPU/（g 葡聚糖）、β-葡萄糖苷酶 64 pNPGU/（g 葡聚糖）。 酶解条件是温度设定为 50 ℃，摇床转速为 150 r·min-1.酶解取样时间分别为 24、72 h.酶解取样 1 mL 放入离心管，放置加热器（设置温度 99 ℃）中加热 20 min,使酶蛋白变性失效，放入-20 ℃冰箱冷却 5 min,再放入离心机（艾本德 5424,设置转速 14500 r·min-1）离心 5 min,经 0.22μm 一次性针头过滤器过滤（聚醚砜膜）后转入 HPLC 分析瓶，放入 4 ℃或-20 ℃冰箱冷藏待分析。

　　1.2.4 单糖的测定酸解或酶解液中糖的定量分析用 HPLC 法， 设备为带示差检测器的 Agilent Technologies 1200系列色谱仪。 采用 BioRad 公司的 HPX-87H 色谱柱（该色谱柱可适用于中性或酸性溶液），流动相为0.005 mol·L-1稀硫酸，流速为 0.60 mL·min-1,柱温为 50 ℃。

　　1.2.5 酶解率计算酶解转化率（酶解率）为实际获得单糖含量与理论最高可得单糖含量之比，而理论最高可得单糖根据原料中经组分分析（二步酸解法，LAP002）的聚糖含量进行折算。 以葡聚糖的酶解率为例，其计算公式是：【1】

　　
　　酶解率 d 为百分数，式中分子为酶解所获得葡萄糖含量折算成葡聚糖的量，其中 g 为酶解液中葡萄糖的含量 （单位为 g/L），15 为酶解液的体积，162/180 为化学式中葡萄糖因聚合失去一个水分子的比例； 分母为理论上加入的葡聚糖量，b 为加入的原料干基质量，c 为组分分析（酸解法）葡聚糖含量。

　　2 结果与讨论

　　2.1 原料成分分析

　　原材料的组分如表 1 所示，碳水化合物和木质素含量通过二步酸解法分析获得，灰分通过箱式电阻炉加热分析获得。 秸秆中葡聚糖（纤维素）和木聚糖的含量合计为 56.21%,这是理论上可以转化为单糖的聚糖主要来源。

　　2.2 预处理温度对酶解效果的影响

　　预处理温度对酶解率的影响如图 1 所示， 横坐标为预处理温度，即预处理加热到此温度下并保留一定时间的温度（实验过程中温度波动范围为±5 ℃）；葡聚糖/木聚糖的转化率用柱状图表示（左侧纵坐标），每千克干基秸秆原料获得的单糖量为点线图（右侧纵坐标）。 本实验固定液氨与原材料（干基）质量比为 1∶1, 其他预处理条件预设为含水率 60%、预处理驻留时间为 5 min. 在 70℃~130℃范围内，葡聚糖酶解率的总体变化趋势是随着温度升高而增加，在 90 ℃后，提升更趋缓慢； 木聚糖酶解率在 90 ℃有较大值，110 ℃有所下降，130 ℃又有提升。 单糖总体得率随着温度升温而略有上升，90 ℃时葡聚糖和木聚糖的转化率分别为 86.0%和79.2% , 每千 克干基秸秆可得单糖 524.7g, 转化率约为理论最高转化率的 83.3%;130 ℃时葡聚糖和木聚糖的转化率分别为91.8%和 82.1%,可得单糖 554.4 g,转化率约为理论量高转化率的 88.0%.LAT 预处理的优化温度略高于 AFEX 预处理，AFEX 预处理用于玉米秸秆的优化温度为 90 ℃[16],而 LAT 预处理在 90~130 ℃均具有较好的效果。LAT 预处理后的酶解率与 AFEX 相当，AFEX 在优化条件下，添加纤维素酶 15 FPU/（g 葡聚糖）的 72 h 葡聚糖和木聚糖的酶解率分别为接近 90%和 70%[18],本研究中的 130 ℃预处理后的酶解效果优于 AFEX.

　　2.3 预处理含水率对酶解效果的影响

　　预处理含水率是指预处理前物料的含水率，采用的是水分与干基物料的比例（此处为干基水分含水率），含水率对玉米秸秆葡聚糖和木聚糖的酶解率的影响如图 2 所示。 实验中含水率分别采用20%、40%、60%、80%,其他反应条件为 90 ℃、氨与 秸秆质量比为 1∶1,反应时间为 5 min. 在实验区间范围内，含水率在 60%时具有最高的转化率，此时葡聚糖和木聚糖 72 h 酶解率分别为 85.97%和79.15%,每千克秸秆可得单糖 524.7 g.预处理前含水率的变化对酶解效果的影响与 AFEX 用于玉米秸秆的情形相近，为 60%[18];但与芒草等作物存在差异，芒在 AFEX 中最佳含水率出现在 80%和 200%[19],LAT 法在其他类生物质原料中的应用有待进一步研究。

　　2.4 预处理驻留时间对酶解效果的影响

　　LAT 预处理驻留时间对酶解效果的影响如图 3 所示，实验驻留时间分别为 3、5、10 min,其他条件为 90 ℃、含水率 60%、氨与原料比为 1∶1.葡聚糖和木聚糖的转化率在驻留时间 3~10 min 范围内，转化率呈先上升后下降的趋势，在驻留时间为 5 min 时达到峰值。 随着预处理时间加长，可能是聚糖或单糖分解导致酶解率下降，其原因待进一步分析。
　　
　　2.5 质量平衡

　　预处理与酶解的质量平衡流程图如图 4 所示。 采用的预处理条件为：预处理温度 130 ℃、含水率 60%、驻留时间为 5 min、液氨与生物质比例为 1∶1,纤维素酶添加量为 15 FPU/（g 葡聚糖），72 h葡聚糖和木聚糖的酶解率分别为91.8%和 82.1%,1000 g 干基 玉米秸 秆 经 预 处 理 后 固 体 得 率 为95.35%,72 h 酶解后可获得单糖524.3 g （仅计算葡萄糖和木糖），而未作预处理的单糖获得量为228.3 g,预处理后单糖得率是未处理原料的 2.1 倍。 从质量分析中可以看出，木糖在酶解转化中占了相当大的比例，约占总糖量的 36%. 如何使木糖在预处理过程中不被降解，并且在后续发酵过程中充分转化为乙醇（采用基因工程改造的菌种），这在纤维素乙醇研究中非常重要。 同时，质量平衡在预处理方法对比过程中非常重要[20],也值得研究者充分关注。

　　2.6 预处理效果比较

　　国外学者采用氨水预处理的 ARP 法和 SAA（法，葡聚糖的 15 FPU/（g 葡聚糖）、72 h 的酶解率分别为 88.5%[13]和 92.5%[14], LMAA 法乙醇的理论得率为 90%[15]. AFEX 法预处理用于玉米秸秆的酶解率比较高，一般在 90%左右[16,18]. LAT 和 AFEX 法由于采用的是液氨，未参与反应的氨可以再利用或回收，有利于降低成本和环境保护。

　　不同的预处理方法用于玉米秸秆，酶解效果存在较大的差异。 如酸预处理，采用乳酸或乙酸及混合预处理，这 3 种方法的葡聚糖的转化率为 83.92%~94.28%,木聚糖的转化率 58.78%~81.08%[21];玉米秸秆经 1%稀硫酸溶液浸润后经 121 ℃处理 60 min,72 h 后原料的酶解率为 62.5%（纤维素酶添加量 6 FPU/（g 葡聚糖））[6]. 如碱预处理，预处理条件为 1.5%NaOH,80 ℃下反应 1 h 时，48 h 纤维素酶解率 71.29%,半纤维素酶解率 78.85%,总糖得率比未处理样品提高 46.66%[7]. 水热法预处理后48 h 酶解率为 63.13%[8]; 汽爆预处理后纤维素与半纤维素酶解率分别为 81.5%和 55.3%（纤维素酶添加量为 10 FPU/（g 葡聚糖），144 h 酶解）[22];采用微波和酸化汽爆的优化条件下预处理 ,在添加纤维素酶 12 FPU/（g 葡聚糖）时，葡聚糖的转化率分别为 47.5%和 62.5%[9]. LAT 预处理在优化条件下，葡聚糖与木聚糖的酶解率分别为 91.8%和 82.1%,与酸、碱、热水、汽爆等预处理方式相比，酶解率相对较高。

　　3 结论

　　通过对玉米秸秆的 LAT 预处理和酶解糖化过程的实验研究，有如下结论：

　　（1）LAT 预处理能显着提高玉米秸秆原料的酶解率，预处理原料经酶解后的单糖产量是未经预处理的 2.1 倍，LAT 法预处理后的酶解率和单糖得率高于酸、碱、水热和汽爆法等。

　　（2）LAT 法预处理的优化条件是预处理温度为 90~130 ℃、含水率为 60%（干基）、预处理驻留时间为 5 min. 在此优化条件下（130 ℃），在纤维素酶添加量为 15 FPU/（g 葡聚糖）时，玉米秸秆中的葡聚糖和木聚糖 72 h 酶解率分别为 91.8%和 82.1%,每 kg 干基秸秆可得单糖 524.3 g.

　　（3）温度、含水率和驻留时间都对预处理的效果有影响，而温度的影响为最大。

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