中药硕士开题报告(3)

　本论文分为4各部分，首先第一部分文献综述及本课题研究方案设计

　　本部分首先分别对茵陈篙汤保肝作用的药效物质基础研究现状、血清药理学与血清药化学相结合的中药药效物质研究进展进行了文献综述，在此基础上简要介绍了本课题的研究思路和方案设计。

　　第二部分实验研究在血清药理学研究过程中需要解决含药血清供体动物的选择、给药方案、采血时间及采血方式的确定等关键技术。本部分主要针对茵陈篙汤含药血清的制备方法、肝细胞损伤模型的复制及体系中含药血清的添加量等进行了考察，建立的血清药理学研究方法为后续采用含药血清谱一效、量一效关系分析研究该复方保肝作用的药效物质基础奠定了基础。

　　第三部分茵陈篙汤血清药化学研究本部分研究主要采用指纹图谱技术及HPLC/DAD检测，对茵陈篙汤含药血清中的原形成分和代谢产物（本课题组将其统称为“血中药源性成分，进行了定性鉴别，对主要成分进行了定量分析，建立的血清药化学研究方法为后续采用含药血清谱一效、量一效关系分析研究该复方保肝作用的药效物质基础奠定了基础。

　　第四部分茵陈篙汤保肝作用药效物质基础的谱一效、量一效关系分析中药药效物质基础的谱效相关性分析是将中药指纹图谱中化学成分的变化与其药效结果联系起来，不仅可以使指纹图谱中化学成分体现相应的药效，而且还能阐明指纹图谱特征与药效的相互关系，从而确定相应的药效物质基础，本研究以茵陈篙汤不同时间点含药血清指纹图谱中的化学成分的变化和其保肝作用的药效相结合，运用双变量相关性分析及多元回归分析，建立茵陈篙汤不同时间点含药血清保肝作用的谱效及量效关系，以期初步阐明该方剂的保肝作用的药效物质基础。

　　6、研究条件和可能存在的问题。

　　本课题主要采用血清药化学和血清药理学相结合的思路，对茵陈篙汤保肝作用的药效物质进行了研究，但由于实验设备和经费问题，对茵陈篙汤及其拆方体内的化学成分只是用了HPLC-DAD检测，未能结合HPLC-MS/MS等检测手段进一步分析鉴定其他成分；此外本研究建立的谱一效、量一效关系分析的药效物质基础缺少必要的活性验证。下一步将采用HPLC-MS/MS等多种检恻手段以及其他的更全面的谱一效、量一效关系分析方法，例如偏最小二乘回归、灰色关联度分析等建立更准确全面的谱一效、量一效关系，并对分析出的成分进行活性验证以及质量控制标准的研究，进一步阐明该方剂保肝作用的药效物质基础，为开发成分清楚、质量可控、疗效稳定的创新中药，造福更多的肝病患者奠定坚实基础。

　　7、预期的结果。

　　本课题在建立了包括含药血清制备方法、肝细胞损伤模型的建立、体系中含药血清添加量考察在内的茵陈篙汤血清药理学研究方法和包括含药血清指纹图谱的建立和含药血清中主要药源性成分含量测定方法的建立在内的茵陈篙汤血清药化学研究方法的基础上，以全方灌胃给药后采集的10个时间点含药血清和7个拆方配伍灌胃给药后采集的固定时间点含药血清为研究对象，一方面测定了这17份含药血清指纹图谱及其中主要药源性成分的含量，另一方面对这17份含药血清进行了活性评价，最后分别采用药时曲线和时效曲线比较及数据处理技术对血清药化学和血清药理学研究结果进行了谱一效和量一效关系分析，初步阐明了茵陈篙汤保肝作用的药效物质基础。主要研究结果如下：
　　（1）优选的茵陈篙汤含药血清制备方案为：每天以成人等效剂量10倍的茵陈篙汤提取物间隔8h分两次给正常大鼠灌胃给药，连续3天，末次给药后1h采集血浆。
　　（2）建立的血清药理学研究方法为：0.5mmo1/L HZO:作用于HL-7702肝细胞4h,加入CCK-8孵育0.5h后测定细胞增殖率；2.5mmol/L Hz0:作用于HL,-7702肝细胞4h后测定上清液中AST;体系中加入5%去蛋白处理后的含药血清进行药效评价。
　　（3）含药血清指纹图谱标定药源性成分共有峰20个，其中238nm下9个，440nm下15个（其中4个为238nm下的共有成分）。所有20个药源性成分中，6个为体外原形成分，14个为体内代谢产物。原形成分中3个分别被指认为来源于桅子的环烯醚菇类成分京尼平普酸和桅子营以及来源于大黄的葱类成分大黄酸，另外3个原形成分中的1个为来源于大黄的葱醒类成分，2个为来源于桅子的西红花酸类成分。14个体内代谢产物的前体成分1个为来源于桅子的环烯醚菇类成分、4个为来源于大黄的蕙醒类成分、9个为来源于桅子的西红花酸类成分。
　　（4）建立了HPLC法测定茵陈篙汤含药血清中京尼平普酸、桅子着和大黄酸3个药源性成分含量的方法，并对10批茵陈篙汤含药血清样品进行了测定，建立的方法简便、准确、专属性强。
　　（5）不同时间点含药血清肝细胞保护作用的谱一效和量一效关系分析结果表明，茵陈篙汤含药血清指纹图谱色谱峰对应的成分中，与肝细胞损伤保护作用相关的成分包括来源于大黄的原形蕙醒类成分及其体内代谢产物、来源于桅子的原形环烯醚菇类成分及其体内代谢产物、来源于桅子的原形西红花酸类成分及其体内代谢产物，其中2个葱醒类成分代谢产物、1个原形蕙醒类成分、1个西红花酸类成分体内代谢产物活性较强。研究结果同时提示，含药血清所含蕙菎类成分大黄酸及桅子营等环烯醚菇类成分可能具有肝细胞保护和损伤双向作用，即低剂量保护高剂量则产生毒性。
　　（6）不同拆方配伍含药血清肝细胞保护作用的谱一效和量一效关系分析结果表明，茵陈篙汤含药血清指纹图谱色谱峰对应的成分中，与肝细胞损伤保护作用相关的成分包括来源于大黄的原形蕙酿类成分及其体内代谢产物、来源于桅子的原形环烯醚菇类成分及其体内代谢产物、来源于桅子的原形西红花酸类成分的体内代谢产物，其中1个蒽菎类成分代谢产物活性较强。

　　8、论文写作进度安排。

　　2015.05-2015.06  分析茵陈篙汤保肝作用的药效物质基础研究现状
　　2015.06-2015.07  茵陈篙汤血清药理学研究
　　2016.02-2016.06  提交论文初稿
　　2016.07-2016.08  确定论文终稿
　　2016.08-2016.09  论文答辩