天仙子泉蝇的快速鉴定探究

　　摘    要：　目的 对青岛胶东国际机场捕获的2只蝇类进行形态和DNA条形码鉴定。方法 对捕获的蝇类, 先进行形态学鉴定, 然后利用DNA条形码技术, 以COI基因为目的基因进行扩增和测序, 分析物种同源性并构建系统进化树。结果2只蝇类样本形态学鉴定为花蝇科, 无法鉴定到种。通过DNA条形码鉴定和序列比对, 2只蝇样本的序列与BOLD数据库中天仙子泉蝇Pegomya hyoscyami的COI基因上一段长达658 bp的序列同源性高达100%, 判断为天仙子泉蝇。结论在青岛机场捕获的蝇类为天仙子泉蝇, 是青岛口岸首次发现。

　　关键词：　DNA条形码; 分子鉴定; 天仙子泉蝇;

　　Abstract：　Objective To identify the unknown flies collected at Qingdao Jiaodong International Airport with DNA barcoding and morphology methods. Methods Morphological identification was conducted, and the COI gene was amplified by using DNA barcoding technology. The sequence was blast and analyzed. Results It was an Anthomyiidae sp. by morphological identification. The sequence of the DNA barcode of it was 100% identical to the 658 bp published sequence with the COI gene of Pegomya hyoscyami in BOLD. It was showed that the unknown fly species were identified as Pegomya hyoscyami. Conclusion Science and technology novely search result showed that it is a non-recorded species in Qingdao.

　　Keyword：　DNA barcoding; Molecular identification; Pegomya hyoscyami;

　　天仙子泉蝇Pegomya hyoscyami隶属双翅目（Diptera）花蝇科（Anthomyiidae）泉蝇属（Pegomya）。1809年，Panzer最早发现天仙子泉蝇，随后Hoffmannsegg和Meigen等人也陆续发现了几种泉蝇，但是都被归入了花蝇属。天仙子泉蝇主要分布在欧洲、北美洲、日本、亚洲西南部和非洲北部，在我国主要分布在青海、甘肃、黑龙江、辽宁、四川、黑龙江、西藏、宁夏等地[1]，在青岛乃至山东省未见报道，本次是首次在青岛口岸发现天仙子泉蝇。

　　传统的分类学方法是利用形态学特征，特别是雄性泉蝇的外生殖器，作为鉴定的依据。但是不同种类泉蝇的形态非常相似，对天仙子泉蝇形态描述的文献较少，口岸送检的蝇类肢体残缺，仅根据形态不能准确鉴定。本研究将形态学鉴定、DNA条形码技术相结合，对在青岛胶东国际机场捕获的蝇类进行快速、准确的鉴定，确定其为天仙子泉蝇。经过科技文献查新，确定为青岛未见分布的新种。

　　1、 材料与方法

　　1.1、 样本及形态学鉴定

　　2018年青岛机场海关捕获的蝇类2只。根据《中国常见蝇类检索表》、《中国蝇类》[2]和天仙子泉蝇的参考文献[2,3]对捕获蝇类进行形态学鉴定，并描述其形态特征。

　　1.2、 分子鉴定

　　1.2.1、 DNA提取

　　用DNA提取试剂盒（Qiagen公司），按说明书从蝇的1条后足提取DNA。
 

　　1.2.2、 DNA扩增

　　以细胞色素C氧化酶基因亚基I (COI）上一段658 bp长的序列为目的片段，所用引物序列为：LCO1490 5’-GGTCAACAAATCATAAAG ATATTGG-3’, HCO2198 5’-TAAACTTCAGGGTGA CCAAAAAATCA-3’[4]。DNA扩增条件[5]：94℃预变性3 min;94℃变性30 s, 52℃退火30 s, 72℃延伸30 s，运行30个循环；72℃延伸10 min。

　　PCR反应体系为：10×PCR缓冲液5μl，引物（20μmol/L）共4μl, dNTPs (10 mmol/L) 2μl;EX-Taq DNA聚合酶（5 U/μl) 1μl；模板DNA 3μl (50ng/μl），无菌水35μl。

　　1.2.3、 测序比对

　　将PCR产物送至上海生工青岛有限公司测序，将获得的双向序列进行拼接，去掉两端的引物后，将所得序列上传至NCBI的GenBank和BOLD System v4进行比对，根据比对结果选取物种序列，使用Mega 10.0软件建立系统进化树。

　　2、 结果

　　2.1、 形态学鉴定

　　蝇样本在解剖镜下形态见图1。形态特征：额宽，有口器，眼裸，喙较短，触角黑，胸部覆淡灰色粉被，中胸盾片暗色纵条，腹部和胸部无斑纹，足黄。翅膀的第6纵脉（Cu1+an1）的使端呈褶状，末端伸至翅后缘，第4纵脉（m1+2）长且直。初步判断为雌性花蝇，但无法准确鉴定到种。

　　图1 青岛机场捕获的蝇类形态

　　2.2 、天仙子泉蝇的形态特征

　　为便于今后对天仙子泉蝇进行形态鉴定，将天仙子泉蝇的形态特征归纳如下。

　　雄性：眼裸，至多具疏短微毛；雄额狭，通常无间额鬃和上眶鬃；触角黑，通常部分带黄色；触角芒裸或具毳毛；口前缘不突出；上倾口缘鬃1～2行，或多达4行；喙较短，唇瓣发达。胸部覆淡灰色粉被，中胸盾片暗色纵条单；中鬃常不规则；背中鬃2+3；翅前鬃仅少数缺如；背侧片常裸；小盾下面具毛；翅c脉腹面具毛；下腋瓣通常不突出。足黄，仅少数黑。后胫后背鬃一般为2，极少数为1或3，前背鬃2。雄肛尾叶单纯；侧尾叶二分叉或具多个分支；前、后阳基侧凸通常都发达；阳体形态多样，但通常较短；侧阳体发达；侧尾叶内、外两枝较宽地分开，分叉点起自基部，后面观末端尖锐，常呈扭曲的锥状，外枝短，钝秃，侧面观内枝末端呈钩状或爪状，外枝多数细，指向前方；肛尾叶小；第5腹板单纯、常形；前胫仅具1个后腹鬃；翅前鬃显然短于后背侧片鬃。

　　雌性：雌额宽，上眶鬃发达，通常无间额鬃；其余与雄性相似。

　　2.3、 基因扩增及序列比对

　　经PCR扩增，得到符合目的片段长度的扩增片段（图2）。经双向测序、拼接，得到有效长度为658 bp的序列。序列与GenBank中天仙子泉蝇（GenBank号：MG118904.1) COI基因相似性为97.39%，与BOLD数据库中天仙子泉蝇（序列号：ACD8746）相似性为100%。

　　图2 COI基因片段扩增结果

　　2.4 、系列进化树构建与分析

　　选取GenBank中与目的片段核苷酸序列相似度较高的8个物种序列，用Mega 10.0构建进化树（图3）。NJ进化树上所标数字为置信度）。可判断本研究的蝇类为天仙子泉蝇。

　　图4 基于COI基因序列构建的系统进化树

　　3、 讨论

　　在口岸捕获的稀有昆虫物种常因缺乏相关的形态资料、肢体残破等原因而无法准确地鉴定。大量实验数据证实，线粒体COI基因上一段长658 bp的片段进化速度、种间差异适宜，可以作为物种鉴定的理想条形码[6]。本研究在青岛胶东国际机场捕获的蝇类，由于形态不完整，无法通过形态学准确鉴定到种。采用DNA条形码技术，通过扩增COI基因，经序列比对鉴定为天仙子泉蝇。

　　泉蝇属广泛分布于世界各地，在全世界已知260余种，我国已知116种，约占世界的泉蝇属的44%[2]。由于泉蝇属的外部形态相似，多年来对泉蝇属昆虫的系统分类始终是个难点。长期以来，国内对天仙子泉蝇的认识较少且颇多混淆[7]，甚至在最新的中国口岸医学媒介生物名录中也未记载天仙子泉蝇[8]。天仙子泉蝇及其近源种是泉蝇属中比较特殊的一群，农业上也被称为甜菜潜叶蝇，1959年Pegomya hyoscyami被报道为甜菜潜叶蝇[9]，直到1986年才命名为天仙子泉蝇并建立检索表[7]。

　　天仙子泉蝇幼虫具有植食性，是藜科和茄科植物的害虫，主要危害甜菜、菠菜、茄子等十余种农作物和野生植物[7]。天仙子泉蝇种团鉴别特征是侧尾叶内外两枝较宽的分开，分叉点起自基部，后面观末端尖锐，常呈扭曲的锥状，外枝短，钝秃，侧面观内枝末端呈钩状或爪状，外枝多数细，指向前方，肛尾叶小，第5腹板单纯，长形，前胫仅具1个后腹鬃，翅前鬃显然短于后背侧片鬃[3]。

　　天仙子泉蝇主要生活在较寒冷地区，即年平均气温7～15℃等温线范围。在我国，天仙子泉蝇1年繁殖3代，以蛹的形式在土中越冬[10]，幼虫通常从4月份开始出现，成活的最适温度范围为14.2～17.4℃。青岛市4月的平均温度10.9℃，温度范围7.9～15℃，适合天仙子泉蝇生存和繁衍。本次天仙子泉蝇是在本底调查中首次捕获，如果大量繁衍很可能对青岛的生态系统、农作物经济带来一系列危害，需要进一步监测。

　　参考文献

　　[1]姚志平.中国泉蝇属系统分类研究 (双翅目:花蝇科) [D].沈阳:沈阳师范大学, 2011.
　　[2] 薛万琦, 赵建铭.中国蝇类 (上册) [M].沈阳:辽宁科学技术出版社, 1996.
　　[3]姚志平, 薛万琦.中国泉蝇属种团研究 (双翅目:花蝇科) [J].沈阳师范大学学报 (自然科学版) , 2011, 29 (1) :104-107.
　　[4]宋文慧, 薛万琦, 王明福.中国泉蝇属区系研究 (双翅目:花蝇科) [J].沈阳师范大学学报 (自然科学版) , 2007, 25 (2) :229-233.
　　[5]刘德星, 岳巧云, 廖俊蕾, 等.国内未见分布蝇种:澳洲麻蝇的形态和DNA条形码鉴定[J].中国媒介生物学及控制杂志, 2015, 26 (3) :282-286.
　　[6]岳巧云, 邱德义, 单振菊, 等.基于DNA条形码和子宫骨片形态特征的8种雌性麻蝇种类鉴定[J].中国媒介生物学及控制杂志, 2016, 27 (5) :340-347.
　　[7]张勤, 王晓梦, 岳巧云, 等.河南口岸截获未知蝇种细胞色素C氧化酶亚基基因分析[J].中国媒介生物学及控制杂志, 2016, 27 (4) :354-357.
　　[8]范滋德.我国的天仙子泉蝇群并记一新种 (双翅目:花蝇科) [J].昆虫分类学报, 1986, 8 (1) :25-33.
　　[9]王海军, 李俊成, 杨晨光, 等.最新中国口岸医学媒介生物名录[J].中国国境卫生检疫杂志, 2009, 32 (3) :163-181.
　　[10]陈道宏, 刘仕龙.甜菜潜叶蝇 (Pegomyia hyosciami Panz.) 的研究[J].昆虫知识, 1959 (5) :152-155.