蚊虫的代谢抗性和靶标抗性研究综述

　　摘    要：　蚊虫抗药性机制的研究对抗药性监测、治理等具有重要意义。随着分子生物学、基因组学的发展，蚊虫抗药性的分子机制得到普遍验证。蚊虫的抗性机制主要有代谢抗性、靶标抗性和行为抗性。现主要针对代谢抗性和靶标抗性进行综述，了解广泛使用杀虫剂之后蚊虫抗性产生的分子机制。

　　关键词：　蚊虫; 抗药性; 代谢抗性; 靶标抗性;

　　Abstract：　The study on the mechanism of mosquito drug resistance is of great significance to the monitoring and management of drug resistance. With the development of molecular biology and genomics,the molecular mechanism of mosquito resistance has been widely verified. The main resistance mechanisms of mosquitoes are metabolic resistance,target resistance and behavioral resistance. Metabolic resistance and target resistance are reviewed to understand the molecular mechanism of mosquito resistance after extensive use of insecticides.

　　Keyword：　Mosquito; Insecticide resisatance; Metabolic resistance; Target site resistance;

　　蚊虫可传播多种疾病，如疟疾、登革热、丝虫病等，是重要的病媒生物之一，其行为与人类生活息息相关，对人类健康威胁巨大。因此，防治蚊虫传播疾病尤为重要。目前，使用化学杀虫剂是最主要的控制蚊虫数量的手段，因其具有广谱、高效、持久等特性，在全世界范围内广泛使用。拟除虫菊酯类药物具有经济、毒性低、效率高等优点，是当前使用最广泛的一类杀虫剂[1]。然而，近年来拟除虫菊酯大量、连续的使用，导致蚊虫抗药性的产生，且日益严重。据美国疾病预防控制中心（CDC）提供的数据显示，截至到2015年，在世界范围内已有125种蚊虫对此类杀虫剂产生了抗性[2,3]。由于蚊虫抗性日趋严重，降低了防治效果，现已成为全世界蚊虫防治工作中的突出问题。

　　1、 代谢抗性

　　1.1 、细胞色素P450(cytochromeP450)

　　细胞色素P450代表着一个很大的可自身氧化的亚铁血红素蛋白家族，属于单氧酶的一类，因其在450纳米有特异吸收峰而得名。它参与内源性物质和包括药物、环境化合物在内的外源性物质的代谢，是代谢抗性最主要的机制之一，其作用是与底物结合并把电子从还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）传递到NADPH P450还原酶[4]，被认为是昆虫对杀虫剂特别是对DDT和拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗性的主要原因之一。蚊虫体内对拟除虫菊酯类杀虫剂的解毒作用，P450s较其他解毒酶的作用更明显[5]。
 

　　Ibrahim等[6]报道在非洲地区野外采集的对拟除虫菊酯类杀虫剂抗性的致死按蚊（Anopheles funestus），体内CYP6P9a和CYP6P9b高表达，并通过定点突变和功能分析证实CYP6P9b基因的3个关键氨基酸改变是造成其产生高抗性的重要原因。公茂庆等[7]从淡色库蚊对溴氰菊酯抗性品系4龄幼虫中克隆出P450全长cDNA基因，基因全长1639bp，开放阅读框1527bp，共编码508个氨基酸，与公共数据库比对后发现，与日本致倦库蚊的P450基因（AB001324）有99%的同源性。用半定量RT-PCR和实时定量PCR均验证出统一结果：对溴氰菊酯抗性品系含量高于敏感品系，CYP6F1基因可能与蚊虫抗药性有关，且因选择压力的不同，P450的表达水平也不同。另外，Riveron等[8]报道，在赞比亚对拟除虫菊酯类杀虫剂抗性较高的致死按蚊种群中，CYP6M7表达水平高于CYP6P9a和CYP6P9b，且CYP6M7更具有多样性，如突变位点及数目（226个）、单倍型及数目（51个）等。朱昌亮等[9]分离对溴氰菊酯和抗性品系淡色库蚊P450基因，获得112个阳性克隆，其中有24个测序后显示为新序列，分别为CYP4家族的4个亚家族（CYP4C、CYP4D、CYP4H、CYP4J），对来自敏感品系的两个片段（NYDS3和NYDS5）以及来自抗性品系的四个片段（NYDR6、NYDR9、NYDR15和NYDR17）的cDNA芯片信号亮度值进行比较，发现抗性品系均大于敏感品系，抗性倍数在3.1～9.7倍，说明淡色库蚊CYP4与溴氰菊酯抗性有关。

　　1.2 、非专一性酯酶（ESTs)

　　非专一性酯酶在蚊虫对有机磷类、氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性中发挥重要作用，尤其是羧酸酯酶[10]。羧酸酯酶是自然界多数昆虫体内含有的一类重要解毒系，主要是利用水解蛋白和结合蛋白对药剂进行解毒，随着解毒过程的进行，羧酸酯酶活性越高，产生的抗性越强。国内已有部分研究表明蚊虫抗性机制与羧酸酯酶有一定关系，徐建敏等[11]研究发现白纹伊蚊对拟除虫菊酯类杀虫剂的代谢速率与其体内羧酸酯酶的活性存在正相关关系，吴能简等[12]研究发现，羧酸酯酶活性升高，白纹伊蚊对氯菊酯的抗性水平也相应的升高。

　　1.3 、谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione-S-transferase,GSTs)

　　GSTs是多功能解毒酶系，参与许多内外源有毒物质的代谢，可以代谢拟除虫菊酯类杀虫剂诱导脂类过氧化物，使组织免受氧化损伤，还可以与拟除虫菊酯类杀虫剂分子鳌合从而起到保护作用[13]。

　　GSTs活性增高是DDT脱氯化氢酶（DDT dehydrochlorinase，将DDT转变为无毒的DDE，对DDT类似物也有催化降解作用的酶）活性增强从而形成抗性的一个重要机制。

　　GSTs可以参与蚊虫对拟除虫菊酯类杀虫剂抗性的产生，非洲中西部，对DDT和氯菊酯均有抗性的致死按蚊中也发现GSTE2的高水平表达，并通过全基因转录组的功能分析、结构种群遗传学的研究，证实其高表达是由GSTE2的单氨基酸（L119F）改变联合转录增加造成[14]。Jones等[15]报道，布基纳法索城区DDT抗性的阿拉伯按蚊（An.arabiensis），体内GSTD3表达上调。再次证明GSTs基因表达上调是导致GSTs解毒代谢增强的重要机制。

　　2 、靶标抗性

　　靶标抗性又称击倒抗性，与杀虫剂作用的靶标位点敏感度下降有关，与其相关的靶标主要有神经轴突钠离子通道（sodium channel,SC）、乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase,AChE）和γ-氨基丁酸受体氯离子通道（γ-aminobutyric,GABA）。

　　2.1、 神经轴突钠离子通道（SC)

　　神经毒理学研究表明：拟除虫菊酯引起神经兴奋性是因为延迟神经细胞钠离子通道的关闭，也就是拟除虫菊酯占领钠离子通道结构域Ⅱ和Ⅵ的S6片段（位于钠离子通道内外两侧之间的疏水性区域），从而延长钠离子通道的失活过程，产生持久的活性，导致阻断了神经传导。

　　刘宏美等[16]利用PCR以及AS-PCR等技术研究发现，淡色库蚊kdr基因突变与溴氰菊酯抗药性有关。NATAHASHI等[17]研究表明拟除虫菊酯类杀虫剂主要作用于蚊虫的钠离子通道，引起钠离子通道内氨基酸结构发生变异，从而延缓了钠离子通道的关闭，进而引起蚊虫神经冲动的重复后放，与此同时还阻断了突触传递的进行。宋锋林等[18]采用RT-PCR技术，使用简并引物分别从淡色库蚊敏感品系和抗溴氰菊酯品系中扩增出纳通道ⅡS4-ⅡS6区域的基因片段，长度为359bp。通过序列比对，发现抗性品系钠通道第Ⅱ结构域S6节段1014位点上的碱基“A”突变为“T”，导致相应氨基酸改变，使苯丙氨酸取代亮氨酸，神经钠通道与拟除虫菊酯类杀虫剂结合能力下降，蚊虫的靶标抗性产生。

　　2.2、 乙酰胆碱酯酶（AchE)

　　有机磷和氨基甲酸脂类杀虫剂的靶标是AchE。蚊虫对有机磷和氨基甲酸脂类杀虫剂的靶标抗性是由于编码AchE的基因突变所致。有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂，将酶活性位点的丝氨酸羟基磷酸化从而不可逆地抑制酶的活性，使乙酰胆碱的分解受阻，导致神经系统中乙酰胆碱浓度的积聚，使突触后神经持续冲动，神经系统的敏感性降低，最终导致生物体的死亡。蚊虫中有AchE1和AchE2两种，分别是ace-1和ace-2，其中ace-1与蚊虫抗药性有关，发挥乙酰胆碱酯酶的生理功能，其编码基因位于第二条染色体上。Liebman等[19]检测到秘鲁的淡色库蚊第119密码子的第2位点的突变出现在第1位点突变之前，提示淡色库蚊种群，等位基因的突变可能是固定向前移动的。王新国等[20]实验显示淡色库蚊抗DDVP品系AchE的活性随抗性选育的世代增加及抗性增高而降低，抑制率小于30%的个体频率逐渐增高，与蚊虫抗性发展呈正相关。

　　2.3 、γ-氨基丁酸受体氯离子通道

　　γ-氨基丁酸属于抑制性神经递质，其合成受谷氨酸脱酸梅控制，与GABA受体结合后可发挥其生物学功能，即引起神经传递的抑制，使突触后神经元处于保护性抑制状态[21,22]。环戊二烯类和阿维菌素类、吡唑类（如锐劲特）、二环磷脂类和二环苯甲酸酯类杀虫剂的作用靶标是GABA受体-氯离子通道复合体，GABA与受体结合后快速打开氯离子通道。然而抗性蚊虫的GABA受体与杀虫剂亲和性低。目前研究认为，这种亲和性降低是由于基因突变所致。Asih等[23]报道在印度尼西亚的154种疟疾蚊虫样本中，检测到GABA受体基因RDI突变的等位基因，且这些突变均发生在纯合子中。

　　3、 讨论

　　随着各种杀虫剂的大量混合使用，蚊虫的抗药性问题日益严重，对蚊虫抗药性机制的研究具有重要的意义。随着人们对分子生物学和遗传学的不断深入研究，对蚊虫抗性品系的基因进行分离、克隆和差异表达的鉴定，进而更加深刻认识抗性的产生和发展，对杀虫剂的使用具有重要指导作用。

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