温室粉虱伪蛹羽化统计及烟粉虱携带TYLCV情况检测

　　温 室 白 粉 虱 Trialeurodes vaporariorum（ Westwood） 和烟粉虱 Bemisia tabaci （ Gennadius）均是重要的世界性昆虫，它们的寄主范围非常广泛，主要危害棉花、蔬菜和花卉等植物。两者危害特征极为相似，均可以通过直接刺吸植物汁液致使植株衰弱矮小，分泌蜜露诱发煤污病，影响植物光合作用，导致作物产量和品质下降，以及传播病毒等多种方式对农业生产造成直接或间接的危害 （ Brown et al. ,1995; 李清西等，1997; 胡敦孝等，2001） .与温室白粉虱比较，烟粉虱寄主范围更广泛、适应性更强、危害更严重、抗药性更强 （ 杨秀清等，2001） .烟粉虱还是传播双生病毒如番茄黄化曲叶病毒 （ TYLCV） 、番茄斑驳病毒（ ToMoV） 、撒丁岛番茄黄化曲叶病毒 （ TYLCSV）等许多植物病毒的重要媒介 （ 纠敏等，2006） .烟粉虱是含有多种生物型/隐蔽种的复合种，其中 B型与 Q 型是入侵性较强、分布较广的 2 种。相对于 B 型烟粉虱，Q 型烟粉虱对许多农药尤其对新烟碱类农药具有更强更稳定的抗药性，还具有更强的传毒能力 （ 褚栋等，2007; Pan et al. ,2012;Liu et al. ,2013） .

　　昆虫的越冬是长期适应自然条件及季节变迁、完成生活史的一种生活对策。昆虫越冬基数的大小以及越冬后能否在初春合适的发育温度下正常羽化将决定着来年该虫的发生及危害程度。已有的研究表明，随着温室、大棚等保温栽培设施的大量出现，烟粉虱可以在我国从南到北的温室、大棚 内 越 冬 （ 崔 洪 莹 等，2011; 张 万 民 等，2013） .我们前期调查发现辽宁省温室白粉虱与烟粉虱伪蛹能在最冷月份 （ 1 月） 的温室大棚内存活 （ 张万民等，2013） ; 在该地区所有采集的烟粉虱样品中，Q 型烟粉虱所占比例远远超过 B 型。

　　同时，发现越冬的烟粉虱伪蛹携带双生病毒-番茄黄化曲叶病毒 （ Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV） （ 张万民等，2013） .那么，2 种越冬粉虱伪蛹在初春温度升高后是否可以正常羽化及生长发育，烟粉虱伪蛹羽 化 成 虫 是 否 仍 然 携 带TYLCV,尚需进一步的系统调查。该方面的研究是科学制定烟粉虱防治技术方案的基础，同时对于番茄黄化曲叶病毒病的早春防控也具有重要的指导意义。

　　为了进一步明确温室内越冬后的粉虱伪蛹初春能否正常发育以及烟粉虱携带 TYLCV 的情况，我们于 2013 年 4 月份中旬 （ 可揭棚的时期） 在辽宁省部分县市区的温室作物上采集了粉虱伪蛹，通过在显微镜下的观察统计了粉虱伪蛹羽化情况；鉴别了粉虱种类并对烟粉虱生物型进行了鉴定；然后检测了新羽化烟粉虱携带 TYLCV 的情况。

　　1 材料与方法
　　
　　1. 1 供试虫源采集
　　试验所用的粉虱伪蛹均是在 2013 年 4 月中旬采自于辽宁省部分县市区的温室作物上。摘取有粉虱伪蛹的寄主植物叶片 （ 一个地点至少采集 10片作为一份样品） ,然后将寄主叶片带入实验室进行观察鉴定，其采集地点、寄主作物及样品代码如表 1 所示。【表1】

　　1. 2 粉虱羽化率
　　每样品随机挑取 30 头活的粉虱伪蛹于另一新鲜寄主叶片，放在垫有两层滤纸的培养皿 （ 加数滴水保持一定湿度） 中让其羽化。每天观察粉虱伪蛹的羽化情况 （ 直到不再有伪蛹羽化为止） ,并记录羽化的粉虱数量。
　　
　　1. 3 鉴定粉虱种类
　　在辽宁省部分地区所采集的每个样品中随机取 15 头羽化出的粉虱成虫 （ JP1 地区取 14 头） .

　　将粉虱成虫标本放在载玻片上，将其置于 Nikon 光学显微镜下 （ 目镜 16 × 、物镜 10 × ） ,不使用电源光，仅在自然光较亮的环境下，调整好成虫的复眼角度进行观察，比较种间复眼形态结构的差异以确定粉虱种类 （ 褚栋等，2008） ,分别记录 2种粉虱的数量 （ 表 1） .同时，利用能够鉴别温室白粉虱与烟粉虱的特异性引物进一步进行了区分（ 专利申请号： 201310192726. 5） .

　　1. 4 烟粉虱生物型鉴定
　　将鉴定出的烟粉虱利用 PCR - RFLP 方法快速鉴别其 B 型与 Q 型 （ Chu et al. ,2010） .单头烟粉虱 DNA 提取方法参照褚栋等 （ 2005） ,烟粉虱 mtCOI 片段扩增参照 Chu 等 （ 2010） ,所用引物为 Cl- J - 2195 （ 5' - TTBATTTTTTGGTCATCCAGAAGT - 3‘）和R -BQ -2819（ 5' -CTGAATATCGAGGCATTCC -3’） ,扩增产物大小为 620 bp 左右。分别以已知 B 型、Q 型烟粉虱 DNA 为模板进行 PCR 作为 B 型、Q 型烟粉虱的对照。PCR 产物酶切后以 1. 0% 琼脂糖凝胶电泳分离，EB 染色后在紫外透视仪上观察，记录结果。每份样品检测 10 头 （ 其中鞍山岫岩 XY样品含有 6 头） .同时，为了进一步确定烟粉虱生物型，每份样品的 3 头烟粉虱的 mt COI 的 PCR 产物直接进行双向测序。

　　1. 5 烟粉虱携带 TYCLV 检测
　　使用 TYLCV 特 异 引 物 （ 上 游 引 物 5' -CGCCCGTCTCGAAGGTTC - 3'; 下 游 引 物 5' -GCCATATACAATAACAAGGC - 3‘） （ Picó et al. ,1988） 对 14 份样品中的烟粉虱进行 PCR 扩增，每份样品中所有烟粉虱进行检测 （ 其中鞍山岫岩 XY样 品 含 有 6 头） ,反 应 体 系 参 照 Picó et al.（ 1998） .以已知 TYLCV 基因组为模板作为阳性对照，以水为模板作为阴性对照。取 5 μL PCR 产物，在 1. 0% 琼脂糖上电泳后，EB 染色，凝胶成像观察。

　　2 结果与分析
　　
　　2. 1 粉虱羽化率与物种
　　粉虱的羽化率统计结果显示 （ 图 1） ,辽宁省14 份伪蛹样品均可羽化，平均羽化率 77% ; 其中，4 份样品的羽化率较高 （ 比例≥90% ） ,分别为锦州 TH1、葫芦岛 LSH1、葫芦岛 LSH2 和葫芦岛LSH3.仅有一份样品的羽化率低于 50% ,为朝阳JP1 样品。【图1】

　　
　　通过复眼镜检法鉴别粉虱种类发现 （ 表 1） ,辽宁省 14 份样品中，10 份样品为烟粉虱种群，仅4 份样品为烟粉虱和温室白粉虱混合种群 （ 占样品比例29%） ,分别为鞍山岫岩 XY 样品、大连 WFD样品、葫芦岛 LSH1 样品和盘锦 DW 样品。并且4 份混合种群样品中，仅在鞍山岫岩 XY 样品中温室白粉虱占优势 （ 比例≥50%） .

　　2. 2 烟粉虱生物型鉴定及携毒检测
　　通过 mtCOI 基因片段对辽宁部分地区烟粉虱生物型进行鉴定及系统分析 （ 图 2） ,所有检出的烟粉虱中只检测到了 B 型和 Q 型烟粉虱。PCR -RFLP 方法表明，在 14 烟粉虱样品 （ 包括烟粉虱与温室白粉虱混合样品） 中，仅有 2 份样品为 B型与 Q 型混合样品，为盘锦 DW 样品和丹东 FCH1样品 （ 表 1） ,并且在 2 份样品中 Q 型烟粉虱均占优势 （ 比例≥50%） ,其他 12 份烟粉虱样品生物型均为 Q 型。利用 PCR 检测新羽化烟粉虱体内 TYLCV 的检测，发现 14 份样品中的所有烟粉虱体内均未检测到 TYLCV 的存在。【图2】

　　
　　3 结论与讨论
　　
　　本研究研究发现辽宁省部分地区保护地内的粉虱 （ 含有温室白粉虱与烟粉虱） 初春时期能够正常羽化 （ 羽化率范围为 47% -93%） .这与崔洪莹等 （ 2011） 田间观察结果是一致的。崔洪莹等（ 2011） 研究发现烟粉虱可以在中国越冬北界分布线以北地区的双膜覆盖大棚和日光温室等保护地设施中越冬。本研究还发现，成功羽化的粉虱在多数样品中是以烟粉虱为主，表明当前辽宁省保护地内烟粉虱种群逐步演变为优势粉虱种群。这与露地作物生长季节田间粉虱调查是一致的 （ 张万民等，2012） .同时，在烟粉虱样品中，Q 型烟粉虱所占比例远远高于 B 型占据主导地位，这与辽宁省 2011 年与 2012 年露地作物生长季节烟粉虱生物型调查结果也是一致的 （ 张万民等，2012） .这些结果提示，初春羽化后粉虱种类及烟粉虱生物型与次年粉虱的发生动态是密切相关的。

　　本研究发现，在初春成功羽化的烟粉虱体内没有检测到 TYLCV,这可能与寄主、虫龄及研究的种群数量等相关。首先，本次研究的烟粉虱种群寄主植物中，TYLCV 传播寄主植物如番茄等较少，可能导致 TYLCV 毒源缺乏，从而使烟粉虱获毒概率减小，这可能成为我们没有检测到 TYLCV的主要原因之一。Ghanim 等 （ 1998） 发现取食TYLCV 的烟粉虱在棉花与茄子上的各个龄期以及下一代成虫仍然携带该病毒。如果番茄寄主较多，其体内含有 TYLCV 的概率会较大，下一代成虫可能携带该病毒的概率也会较大。新羽化成虫也可能在很短的时间内可以通过取食携毒植物来获取TYLCV （ 纠敏等，2006） .张万民等 （ 2013） 研究发现辽宁省越冬温室内的烟粉虱伪蛹体内含有TYLCV,其采集的烟粉虱种群大多数来自于番茄寄主。这在一定程度上说 明 了 烟 粉 虱 体 内 的TYLCV 的检出率与采集的植物是否为 TYLCV 感染寄主有关。

　　其次，由于烟粉虱传播 TYLCV 出现了依赖虫龄传播的模式，携带 TYLCV 的烟粉虱成虫可以将病毒垂直传播到第一代后代的卵期并且这段未成熟的时期是其传播 TYLCV 频率最高的阶段，而随着烟粉虱虫龄的增大，其传播频率却在不断地减小，在同一代的烟粉虱蛹期和成虫期就已经无法检测到 TYLCV.出现这一现象的可能解释是随着烟粉虱虫龄的增大体内免疫反应被激活，包括抗菌肽和自噬性溶酶体的产生，导致烟粉虱体内病毒浓度逐渐降低，从而使 TYLCV 仅在未成熟的卵期及幼虫期可以存在，而到了蛹期和成虫期逐渐降低直至消失 （ Pan et al. ,2012） .因此，这也是本研究中在烟粉虱新羽化成虫体内没有检测到TYLCV 另一重要原因。

　　此外，本研究中我们检测的种群数量较少同样可能影响烟粉虱体内 TYLCV 检出率。但是，在温室内的患病植株上如果一直存有着 TYLCV,当新羽化的烟粉虱成虫取食携带病毒植株上的叶片时，仍然会将 TYLCV 传播到健康植株上造成危害。因此，加强越冬代烟粉虱的防控对于早春烟粉虱和番茄黄化曲叶病毒病的防控具有重要意义。