蜱类不同发育期性信息素成分研究

　　Berger[1]首次发现 2,6-二氯酚（2,6-DCP）为后沟类硬蜱中的吸引性信息素（attractant sex pheromone,ASP）成分，目前确定该成分至少在 7 属 18 种硬蜱中存在[2-5].刘敬泽等[6]在长角血蜱（Haemaphysalis longicornis）雌蜱提取物中检测到 2,6-DCP,并研究了该成分在不同发育期的含量变化和生物学作用[6]. 2,6-DCP 作为蜱类防治的药物已有成功先例[7].多年来，人们一直在寻找蜱类性信息素中是否还存在 2,6-DCP 以外的其他物质。 Hanson 等[8]在变异革蜱（Dermacentor variabilis）雌蜱提取物中鉴定出 2,4-DCP,同时确定 2,4-DCP 与 2,6-DCP 的含量比例为1∶9,该物质对雄蜱也具有吸引作用，且 2,4-DCP 可以作为 2,6-DCP 的替代物[9] ,2,4-DCP 和 2,6-DCP 对变异革蜱吸血雄蜱、吸血若蜱具有相同的作用[10-11]. 迄今，仅在革蜱属（Dermacentor）中有 2,4-DCP 的报道。为阐明其他蜱种中是否存在 2,4-DCP,分析该种性信息素成分在蜱类不同发育期的含量变化，本研究以长角血蜱为对象，对其雌蜱挥发性 ASP 的主要成分、生物学作用等进行了分析。

　　1 材料与方法

　　1.1 蜱的采集和喂养

　　长角血蜱采自河北省小五台山国家自然保护区。饥饿的幼蜱、若蜱和成蜱均在兔耳上饱血，非寄生期在人工气候箱中培养，培养温度（26±1）℃，相对湿度75%,6 L（光照）∶18 D（黑暗）。 不同发育期的雌蜱：饥饿期（未吸血）、刚吸血（吸血 1 d）、吸血期（吸血 2~3 d）、交配期（吸血 3~5 d）、交配后（吸血 5~7 d）、饱血当天（吸血 5~7 d），分别取材用于研究。

　　1.2 样品制备

　　将不同发育期的成蜱 20 头分别放入磨口玻璃管中，加入 5.0 mL 正己烷后，封紧玻璃管，置 4 ℃下充分抽提 2 h,正己烷重提 2 次，每次 30 min. 浓缩定容至20 μL,用于生物测定、色谱和质谱分析。

　　1.3 色谱条件

　　1.3.1 气相色谱条件

　　色谱柱为 OV-101 毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.15 μm），气化室温度和 Fid 检测器温度为 280 ℃，柱温为 60 ℃（5 min），以 10 ℃/min 升温至 280 ℃，信号采集时间 25 min,载气为高纯度氮气。

　　1.3.2 质谱条件

　　色谱柱为 DBS-MS 毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.15 μm），气化室温度和 Fid 检测器温度为 280 ℃，柱温为 80 ℃（5 min），然后以 10 ℃/min 升温至 280 ℃，信号采集时间 25 min,载气为氦气。 扫描质量范围为30~800 m/z,电子能量为 70 eV.

　　1.4 生物测定

　　①用蘸有正己烷的脱脂棉在刚开始吸血雌蜱的体表进行擦拭，上、下午各 1 次；②不做任何处理（作为空白对照）；③在①处理后连续 3 d 在雌蜱体表点滴正己烷，每天 1 μL（作为正己烷对照）；④在①处理后连续 3 d 点滴不同发育期雌蜱体表抽提物，每天 1 μL;⑤在（1）处理后连续 3 d 点滴标准样品，分别为 2,4-DCP（100 ng）、2,6-DCP（30 ng）和 2 种成分的混合物（100 ng 的 2,4-DCP 和 30 ng 的 2,6-DCP）。 各处理组重复 5 次。

　　2 结果与讨论

　　2.1 雌蜱不同发育期体表抽提物的生物学测定

　　长角血蜱的生殖行为在吸血 3~5 d 后进行。 刚开始吸血的雌蜱经正己烷擦拭后生殖行为基本中止，施加不同发育期雌蜱的体表抽提物后，长角血蜱生殖行为的恢复程度如表 1 所示。

　　由表 1 可以看出，从饥饿期开始，随着雌蜱发育的成熟，体表抽提物作用于正己烷处理过的长角血蜱后，其完成生殖行为的百分率增大，交配期雌蜱的体表抽提物效果最好。

　　2.2 气相色谱/质谱分析

　　根据不同发育期的雌蜱体表抽提物的生物测定结果，选取典型时期（交配期）样品进行气相色谱/质谱分析，结合 2,4-DC 与 2,6-DCP 标准样品的保留时间和质谱特征。 结果如图 1 所示，可知保留时间 9.90 min的成分为 2,4-DCP,保留时间 10.53 min 的成分为 2,6-DCP.

　　2.3 标准样品的生物测定

　　2,4-DCP 与 2,6-DCP 标准品对交配成功率的效果如表 2 所示。 由表 2 可以看出，未处理的雌蜱（空白对照）均可饱血，擦拭正己烷后的对照组的雌蜱交配成功率不足 10%. 雌蜱体表经正己烷擦拭后无法完成生殖行为，施加测试样品后生殖行为得到不同程度的恢复。 施加 2,4-DCP 的处理组饱血率接近 70%;施加2,6-DCP 的处理组饱血率略高于施加 2,4-DCP 的处理组，差异没有统计学意义（p>0.05）。 2,4-DCP 与 2,6-DCP 混合组分对饱血率的影响高于单独施加其中的一种成分的影响，差异具有高度统计学意义（p<0.01）。

　　2.4 不同发育期雌蜱 2,4-DCP 与 2,6-DCP 分泌量的动态变化

　　通过外标法测定不同发育期时雌蜱的 2,4-DCP与 2,6-DCP 分泌量，结果如表 3 所示。

　　由表 3 可以看出，饥饿期的雌蜱体表已经存在2,4-DCP 和 2,6-DCP;吸血开始后，2 种成分的分泌量都开始增加；交配期达到峰值，此后下降。 在所有发育期，2 种成分分泌量的比例关系基本保持一致。

　　3 结论

　　气相色谱及气质联用分析结果表明，长角血蜱雌蜱所有发育期均可分泌 2,4-DCP 和 2,6-DCP,并随雌蜱发育期而变化，交配期达到高峰，高峰后分泌量又逐渐下降，这与刘敬泽等[12]用气相色谱法在长角血蜱盾窝腺丙酮提取物中检测的 2,6-DCP 含量动态变化基本吻合。 不同发育期，雌蜱体表分泌 2,4-DCP 和2,6-DCP 量的比例基本保持不变，约为 3∶1,而 Hanson等[8]报道的变异革蜱中该比例为 1∶9,这说明不同蜱种间存在差异，可以实现种间识别的隔离。

　　根据硬蜱的交配行为，吸引性信息素由雌蜱在吸血后直至交配前不断释放，刺激并吸引性活动的雄蜱对雌蜱准确定位并完成交配行为。 本研究证实长角血蜱中这 2 种成分的分泌量动态变化与交配行为相吻合，且均对交配行为的完成有显着促进作用，因此可确定 2,4-DCP 和 2,6-DCP 均为性信息素成分，有关两种成分的作用机制及其在蜱类防治中的应用尚需进一步研究。

　　参考文献：

　　[1] BERGER R. 2,6-dichlorophenol,sex pheromone of the lone star tick[J].Science,1972,177（4050）：704-705.

　　[2] SONENSHINE D,KHALIL G,HOMSHER P. Dermacentor variablisand Dermacentor andersoni:genital sex pheromones [J]. ExperimentalParasitology,1982,54（3）：317-330.

　　[3] DE BRUYNE M,GUERIN P. Isolation of 2,6-dichlorophenol from thecattle tick Boophilus microplus:receptor cell responses but no evidencefor a behavioural response [J]. Journal of Insect Physiology,1994,40（2）：143-154.

　　[4] BORGES L,EIRAS A,FERRI P. The role of 2,6 -dichlorophenol assex pheromone of the tropical horse tick Anocentor nitens（Acari:Ixodidae）[J]. Experimental and Applied Acarology,2002,27（3）：223-230.

　　[5] SARA F,LIGIA M. Electrophysiological responses of the olfactoryreceptors of the tick Amblyomma cajennense（Acari:Ixodidae）to host-related and tick pheromone-related synthetic compounds[J]. Acta Tropica,2012,124（3）：192-198.

　　[6] 刘敬泽，姜在阶，李仲来，等。 性信息素 2,6-二氯酚在长角血蜱交配行为中的作用[J]. 昆虫学报，1999,42（1）：31-36.