泌尿科论文
精子携带遗传信息，并在父代与子代之间进行传递。精子发生初始，原始生殖细胞 （ primordialgerm cells,PGCs） 从起源的尿囊基底部移行到生殖脊。在原始性腺定植之后，PGCs 经历 DNA 去甲基化、染色体修饰及亲代印迹的消除等过程。进入青春期之后，男性原始生殖细胞经过完整的减数分裂过程，形成有功能的成熟精子。在精子发生的过程中，任何一个环节的错误均有可能导致男性不育或者其他病理情况的发生。然而，人类精子发生的分子机制仍存在大量未解之谜，一部分原因是由于无法在体外模拟人类精子发生的早期阶段。因此，体外精子发生模型的建立将促进我们深入了解精子发生过程，进而更好地理解不育症的发病机制，有助于男性不育症的临床治疗。
国内外研究人员尝试利用多种类型的干细胞来体外诱导精子发生，包括精原干细胞（ spermatagonialstem cells,SSCs） 、间充质干细胞（ mesenchymal stemcells,MSCs ） 、胚胎干细胞 （ embryonic stem cells,ESCs） ,以及新近出现的诱导多潜能干细胞（ inducedpluripotent stem cells,iPSCs） .其中，SSCs 与 MSCs均属于成体干细胞，是存在于已分化组织中的未分化细胞，常定位于特定的微环境中[1].SSCs 是精子发生的基础，在尽可能模拟生精微环境的条件下，SSCs 比其他类型的干细胞更易诱导精子形成，但是SSCs 的分离纯化较为复杂，且对于自身缺乏 SSCs的不育患者，这一方案也无法实施。MSCs 广泛存在于多种组织中，易于体外扩增，常用的 MSCs 多来源于脐带与骨髓组织[2].然而，研究表明 MSCs 在向精子诱导分化的过程中，可以增强减数分裂相关基因的表达，但是较难跨越减数分裂的瓶颈，可能与自身的分化潜能有关[3].ESCs 是一种高度未分化的细胞，具有发育全能性，且已经实现体外诱导为具有生物活性的精子，但是人 ESCs 的制备面临伦理争议，因而相关研究受到了一定程度的限制。
iPSCs 的出现成功避免了 ESCs 研究的相关争议。个体特异来源的 iPSCs 不会引起免疫排斥反应，且与供体细胞具有完全相同的遗传信息，更为重要的是 iPSCs 的建立不需要卵细胞，也无需破坏胚胎发育，避免了伦理上的限制。因此，国内外研究者们不断在寻求诱导 iPSCs 向生殖细胞分化的方法。
本文将对 iPSCs 在精子发生过程中的相关研究进行综述，并探讨 iPSCs 应用于男性不育症临床治疗所面临的问题以及发展前景。
1 ESCs 诱导精子发生的研究现状
近年来，ESCs 诱导精子发生已经在诸多物种中进行探索，并取得了巨大的研究进展，尤其是小鼠和人 ESCs 体外向生殖细胞分化的大量研究。国外多个研究小组通过拟胚体（ embryoid body,EB） 形成，并经过 BMP4 （ bone morphogenetic pro-tein4,BMP4） 或 RA（ retinoic acid,RA） 诱导可使小鼠 ESCs 分化为各阶段雄性生殖细胞。Geijsen 等[4]证实了小鼠 ESCs 来源的单倍体细胞可以使卵子受精。Nayernia 等[5]更进一步利用小鼠 ESCs 来源的雄性生殖细胞获得了存活的后代，但是存活下来的子代小鼠体型均比对照组大或小，且不能存活超过6 个月，测序结果也表明实验获得的配子并没有完全清除祖父代的甲基化印记，研究人员认为扰乱的雄性生殖细胞特异性甲基化印记是后代表型异常和成熟前死亡的原因。因此，更多的研究需要探索ESCs 来源的生殖细胞与正常的生殖细胞之间甲基化印记的差异及发生机制。Hayashi 等[6]利用贴壁细胞两步分化法，通过一系列细胞因子的作用也使小鼠 ESCs 分化获得了原始生殖细胞样细胞（ PGC-like cells,PGCLCs） ,PGCLCs 来源的精子不仅可以使卵子受精，而且产生了存活的后代。
相比之下，人 ESCs（ hESCs） 诱导精子发生的研究相对比较受限。研究表明，hESCs 来源的 EBs 可以自发向雄性生殖细胞分化，表达多种生殖细胞及单倍体细胞的分子标志物，包括 VASA、BOL、SCP1以及 SCP3 等[7].Chen 等[8]也发现 hESCs 自发向生殖细胞分化。然而，这些研究都阐明这种自发的分化效率非常低且不完全。单层细胞分化法、EB 分化法、新生性腺组织共培养法等均被用来研究hESCs 向 PGCs 的分化，但是诸多的研究均没有跨越减数分裂的瓶颈。通过过表达与精子发生相关的家族基因（ DAZL、DAZ 及 BOULE） ,Kee 等[9]实现了减数分裂并获得了单倍体细胞。一些研究小组在避免基因修饰的同时，也实现了 hESCs 向生殖细胞的分化。Eguizabal 等[10]的 3 步法虽然在 hESCs 分化的细胞中检测到了减数分裂相关标志物的表达，但并未获得单倍体细胞。其后，Easley 等[11]证实了在精原干细胞的培养条件下，hESCs 可以直接分化为单倍体细胞，但是效率很低。由于伦理限制，这些研究获得的生殖细胞并未进行功能探究。
ESCs 诱导分化的相关研究为体外研究精子发生的机制提供了方法参考，同时也为生殖细胞缺乏（ 如非梗阻性无精子症） 的患者带来了希望。然而，ESCs 来源的生殖细胞与不育患者并不存在遗传学上的联系，而且，由于人 ESCs 的建立需要大量的卵细胞，涉及破坏发育中的囊胚，这些问题所涉及的伦理学争议限制了 ESCs 的研究以及在临床上的应用。
2 iPSCs 技术的出现
2006 年，Takahashi 等[12]通过在分化的胎鼠成纤维细胞中表达某些特定转录因子（ Sox2,Oct4,Klf4,c-Myc） ,可诱导体细胞的重编程而获得与 ESC相似的细胞，这些细胞可不断自我更新并具有发育多潜能性，因此被命名为 iPSCs.在建立小鼠 iPSCs后，应用相似的方法，研究者们也很快地建立了人iPSCs（ hiPSCs） .
2007 年，Okita 等[13]已经证实了 iPSCs 可以在嵌合体小鼠中分化为生殖腺细胞。2009 年，中科院的研究小组首次利用 iPSCs,通过四倍体囊胚注射得到存活并具有繁殖能力的小鼠，在世界上第 1 次证明了 iPSCs 的全能性[14],国内外科学家也相继证实了这一结论[15-16].
3 iPSCs 诱导精子发生
hiPSCs 来源于患者的体细胞，建立相对简单，重复性好，不仅可以分化为供体的各种类型细胞，而且避免了免疫排斥及伦理问题，更适合于诱导分化为个体特异性的精子细胞。近年来，许多研究证实iPSCs 具有体外向男性生殖细胞分化的潜力。
2012 年，Zhu 等[17]在无 LIF 的培养液中培养小鼠 iPSCs 获得 EBs,并通过 RA 诱导其分化为表达VASA、CDH1 和 GFRa1 的精原干细胞（ spermatogo-nial stem cells,SSCs） .他们进一步将这些 iPSCs 分化来的 SSCs 移植到白消安处理后生精损伤的小鼠睾丸组织中，这些细胞可以分化为各个阶段的雄性生殖细胞，包括精原细胞到圆形精子细胞，并表达VASA 和 SCP3.Li 等[18]和 Niu 等[19]也通过 EBs 形成及 RA 或睾酮诱导的方法获得了类似的结果。这些研究均证实了小鼠 iPSCs 有分化为晚期雄性生殖细胞的潜力，但是精母细胞标志物联会复合体蛋白3（ SCP3） 的表达并没有增加，说明这些诱导方法并没有使 iPSCs 体外分化为精母细胞。
2013 年，在 Hayashi 等[6]的研究基础上，Li等[20]更为有效地将小鼠 iPSCs 诱导分化为 PGCs 样的细胞，他们首先诱导 iPSCs 分化为上胚层样细胞（ induced epiblast-like cells,iEpiLCs） ,在促进分化的特定培养液中培养 1 ~ 6 d,通过流式分选出Stra8-EGFP 阳性的 PGCs 样细胞 （ induced PGC-likecells,iPGCLCs） ,最终通过 RA 及 BMP4 的诱导作用，获得生殖干细胞样的细胞（ germline stem cell-like cells,iGSCLCs） .同年，Cai 等[21]也报道通过RA 诱导使小鼠 iPSCs 体外分化为 PGCs 样的细胞，他们还将小鼠 iPSCs 与新生小鼠的睾丸组织细胞悬液共同移植到雄性裸鼠的背部，研究者定期利用活细胞成像系统检测移植物的结构，发现移植部位有生精小管的重建，并且 iPSCs 出现了归巢和分化。
2014 年，大部分研究逐渐集中于人特异性疾病来源的 iPSCs,研究者们相继获得各种不育男性体细胞来源的 iPSCs,包括 AZF 缺失、染色体异常等原因所致的不育。鉴于 hiPSCs 的体内研究受伦理限制，研究也主要限于异种移植于小鼠体内。
与 hESCs 相比，hiPSCs 的优势使其更便于进行精子发生的相关研究。2009 年，Park 等[22]将 hiPS-Cs 与胎儿性腺基质细胞共培养，第 1 次证实了 hiP-SCs 可以向 PGCs 样的细胞分化。他们从胎儿性腺组织中提取滋养层细胞，将 hiPSCs 与滋养层细胞共培养，培养第 7 d 观察到出现约 8% ~10% 的 PGCs（ hiPS-PGCs） ,从而证实了 hiPSCs 体外向生殖细胞分化的能力； 在 PGCs 形成的过程中，他们检测了 3个印记基因（ PEG1、H19 和 SNRPN） 的甲基化水平，发现 hiPS-PGCs 印记消除率与 hESCs 有所不同。
2011 年，Panula 等[23]发现胎儿和成人体细胞来源的 hiPSCs 与 hESCs 类似，可以分化为 PGCs.过表达 DAZ 家族蛋白时，分化所得的生殖细胞可以进入减数分裂阶段，并可获得表达顶体蛋白的单倍体细胞。他们还发现 iPSCs 比 hESCs 更易自发向生殖细胞分化，这可能与细胞重编程过程中多能性基因的增强表达有关。
另外一些研究小组通过改变基因表达水平来促进 hiPSCs 向男性生殖细胞进一步分化。Medrano等[24]已经证实过表达一些 RAN 结合蛋白如 VASA、DAZL,可以促进 hiPSCs 分化所得的生殖细胞进入减数分裂阶段。Eguizabal 等[10]首次实现了 hiPSC向减数分裂后细胞的分化。他们设计了三步分化法，首先用不含 bFGF 的 ESC 培养 hiPSCs 3 周，然后加入 RA 继续培养 3 周，分选出 CD9+、CD49f+、CD90-、SSEA4-的细胞，继续在含有 Forskolin、LIF、bFGF 及 R115866（ CYP26 抑制剂） 的条件培养液中培养 4 周，最终获得了各阶段的男性生殖细胞，分别表达精原细胞、减数分裂前精母细胞、减数分裂后精母细胞和圆形精子细胞的标志物，但是，尚需要进一步的研究确定所得的圆形精子细胞是否具有使卵子受精形成胚胎的能力。更为值得注意的是，不经过基因修饰，Easley 等[11]直接在标准的小鼠精原干细胞的培养条件下，使 hiPSCs 分化为单倍体生精细胞。
2014 年，Surani 和 Hanna 等证实 hiPSCs 可以体外分化为原始生殖细胞样细胞（ hPGC-like cells,hPGCLCs） ,并通过一系列实验发现 SOX17 基因是决定 PGCs 命运的标志物，对体外培养出成熟精子起关键作用[25].Ramathal 等[26]将 hiPSCs 异种移植到生精损伤的小鼠睾丸微环境中，发现生育力正常男性来源的 hiPSCs 可以分化为生殖细胞样细胞（ germ cell-like cells,GCLCs） ,然而，Y 染色体 AZF区域缺失男性来源的 hiPSCs 在相同的环境中向生殖细胞分化的能力明显不足。该研究揭示了体细胞微环境与定植的干细胞间存在信息交流，这种细胞间的对话可能是影响 hiPSCs 向生殖细胞分化的重要因素。该研究小组还在传统的 4 个转录因子（ OSKM） 基础上，添加了生殖细胞特异的转录因子VASA,利用 mRNA 介导重编程获得 OSKMV hiPS-Cs,他们发现异种移植到免疫缺陷的无精子症模型小鼠的生精小管后，OSKMV hiPSCs 向生殖细胞分化的能力与 OSKM hiPSCs 明显不同，前者更明显地向生殖细胞分化[27].这些研究都可能促进我们对人类精子发生的遗传分析。
虽然 iPSCs 诱导精子发生已经取得诸多进展，但基础研究中仍有很多问题需要进一步探究。目前尚无研究报道 iPSCs 来源的精子细胞实现了运动功能，只有结构正常的精子才具有良好的运动功能和受精能力； 同时，也需要更多的研究来证实 iPSCs 可以经过整个减数分裂前期、减数分裂期及减数分裂后期的所有变化，进而完成整个精子发生的过程，并尽可能对分化所得的精子细胞进行功能鉴定。
4 iPSCs 应用于临床治疗所面临的问题
虽然 iPSCs 可以诱导分化为生殖细胞，但将其应用于临床治疗仍面对巨大的挑战，如现有分化方案的效率较低，体外基因操作带来的遗传学、表观遗传学改变，iPSCs 自身可能带来的成瘤风险以及伦理道德方面的限制等。
iPSCs 的临床应用首先要解决安全问题。目前iPSCs 制备通常借助逆转录病毒为载体，将几种转录因子转入分化的体细胞，诱导其重编程为 iPSCs.这种方法可能由于外源基因插入细胞基因组，干扰内源基因的表达，同时一些转录因子是致癌基因，可能诱发肿瘤。iPSCs 自身多能性也具有潜在危险性，如畸胎瘤的形成、异常重编程等。为解决病毒载体的安全问题，研究者们也进行了大量的探究，试图通过非病毒载体将多能性相关的基因带入体细胞中，从而实现体细胞的重编程。目前，已有的非病毒载体有质粒、PB 转座子（ piggyBac transposition） 、mRNA、蛋白质介导、microRNA、小分子化合物等。
其中，我国研究小组首先报道的利用小分子化合物实现体细胞向多能干细胞重编程，为 iPSCs 的制备提供了更加简单和安全的方法，成为目前最为理想的诱导方法。他们对多种化合物组合进行优化筛选，最终利用 VC6TFZ（ VPA,CHIR99021,616452,Trany lcyprotamine,Forskolin,dznep） 小分子化合物组合以及后期的"2i"培养液，实现了小鼠胚胎成纤维细胞的重编程，并将诱导而来的多能细胞命名为化合物诱导性多能干细胞（ chemically induced pluri-potent stem cells,CiPSCs）[28].
其次，效率问题也是制约 iPSCs 由实验室走向临床的瓶颈之一，如何提高 iPSCs 的制备效率也是人们普遍关注的问题。最新出现的蛋白质和 mRNA介导制备的 iPSCs 基本避免了插入突变和成瘤风险，但蛋白质介导的重编程效率很低，而 mRNA 介导的重编程效率较高[29-31].同时，我们仍需要进行更为深入细致的表观遗传学研究，分析 iPSCs 基因表达及表观遗传的完整性及特异性。
iPS 技术虽然避免了破坏发育中囊胚的伦理争议，但是并不代表其在道德层面不受质疑，尤其是应用于治疗男性不育症的领域。目前，正是由于伦理及法律限制，我们尚不能利用卵细胞胞质内单精子注射（ ICSI） 技术来证实人 iPSCs 体外分化所得的精子是否能够产生正常的后代。未来进行不育症患者特异性 iPSC 的制备以及临床治疗时，还要建立严格的操作流程及标准来规范组织取材过程，并且做到患者完全知情同意。
5 展望
越来越多的临床资料和流行病学证据表明男性不育的发病率呈上升趋势[32].ICSI 及睾丸穿刺取精技术（ testicular sperm extraction,TESE） 的成熟为非梗阻性无精子症患者提供了获得遗传学后代的机会，但是文献报道 TESE 的平均成功率仅49. 5%[33],超过一半的患者 TESE 失败，他们该如何获得遗传学上的后代，如果能够获得携带患者遗传信息的单倍体细胞，通过 ICSI 技术可能使其获得遗传学上的后代。iPSCs 向生殖细胞分化及在体移植的相关研究为无精子症的干细胞替代治疗提供了新的希望。
iPS 技术可以体外模拟疾病发生，揭示潜在致病机制，通过细胞水平的修正，为患者提供量身定制的细胞替代治疗。目前，已报道的疾病特异性 iPSCs多来自于有明确基因突变所致的疾病，而这些突变多以孟德尔方式遗传[34].然而，大部分疾病的遗传背景是极为复杂的，可能是散发的，也可能是多个基因位点的多态性。在这种情况下，传统的转基因动物或基因修饰的细胞系已经不能满足对疾病发生的模拟。相比之下，iPS 技术具有明显的优势，疾病特异性的 iPSCs 可以来自具有不同表型的患者，即使这些疾病具有复杂的遗传学病因，例如 Y 染色体AZF 区域有缺失的不育患者以及一些病因不明的特发性无精子症患者。我们可以获得特发性无精子症患者特异的 iPSCs,在诱导其向男性生殖细胞分化的过程中，探寻其分化能力的异常或缺陷，为一些病因不明的患者提供更准确的治疗方法。更为有意义的是，利用 iPSCs 模拟精子发生的过程，很有可能促使人们更深入地了解人类精子发生的分子机制。
iPS 技术出现后的短短几年间，iPSCs 向男性生殖细胞分化的研究已经取得了突破性的进展，新建立 iPSCs 的方法也大大提高了其在临床应用上的安全性，进一步拉近了 iPSCs 与男性不育症治疗的距离。生殖细胞缺乏的男性患者可以通过自身体细胞来源的 iPSCs,诱导分化为携带自身遗传物质的生殖细胞，这为男性不育症的治疗提供了新的精子来源。
我们期望早日看到 iPSCs 应用于临床治疗，但是，精子作为遗传物质的携带者，从精子发生到受精以至胚胎发育的任何一个过程都不能出现差错，对形成的精子仍需要进行长期的质量评估。
参考文献：
[1] 杨瑞峰，熊承良。 成体干细胞在男性不育领域的应用及展望。 中华男科学杂志，2013,19（ 5） : 468-471.
[2] 蔡益婷，熊承良。 间充质干细胞的生物学特性及在男性不育中的应用。 中华男科学杂志，2013,19（ 10） : 949-952.