农艺学论文
多倍体植物在自然界中普遍存在，目前在农业生产中，主要农作物都是多倍体，如小麦为异源六倍体、棉花和油菜为异源四倍体、甘薯为同源六倍体，而水稻和玉米为二倍体化的古多倍体。多倍化研究已经成为当前进化生物学、遗传学和基因组学领域的研究热点[1].
多倍体通过自然加倍获得，但数量稀少，频率低，甚至在自然条件下不能正常生长而死亡，难以应用于生产实践中[2],因此，20 世纪初育种家们开始对人工诱导多倍体进行探索。起初，人工加倍的方法是通过物理的手段获得多倍体，如高温、辐射，但诱变率低下，常发生嵌合体[3].1937 年，Blakeslee 等[4]用秋水仙碱加倍曼陀罗等植物的染色体数获得了成功。秋水仙素被广泛应用于培育植物新品种。秋水仙素，即秋水仙碱，纯秋水仙碱呈黄色针状结晶，熔点 157℃，易溶于水、乙醇和氯仿，味苦，有毒。秋水仙素通过作用于有丝分裂中期使染色体加倍。其原理是秋水仙素可以与α - 微管蛋白和 β - 微管蛋白形成的二聚体特异性结合，减少了微管二聚体装配在微管上的数量，结果使微管拆卸的速度大于装配的速度，最终使形成的微管解聚，染色体加倍但细胞质不分裂，因此染色体数目加倍。
最初秋水仙素诱导多倍体是活体进行。通过适当的操作，如点滴、注射、涂抹等诱导植株的顶芽、腋芽等位置，但活体操作时细胞的分裂不能同步，活体诱导较难得到纯合四倍体植株，大多为嵌合体，诱导率低。随着生物技术的发展，离体诱导多倍体的条件已经十分成熟。离体诱变育种有诸多优势： 诱导率高； 试验易于重复进行； 嵌合体发生率低，方便纯化； 时效快、操作方便； 节省空间、人力物力； 便于控制室温、光照等条件等。张蜀宁等[5]利用秋水仙素离体诱导青花菜，得到变异植株 20 株，其中纯合植株有 19 株。秋水仙素离体诱导同源多倍体在种质创新和新品种选育上发挥了重要作用，诱导产生的同源多倍体常伴随植物形态、解剖、生理、栽培特性等方面而改变，如叶片变厚变大、叶色加深、叶绿素含量增加； 花器官、果实变大； 维管束变大、抗逆性增强、生物量或生物有效成分增加等[6].
同源多倍化引起的表型变化及其机理研究亦成为研究热点[7 -8].
本文总结了近十年秋水仙素离体诱导植物多倍体的研究进展，对影响诱导效率的因素如外植体类型、处理方法及其他因素进行了综述，并探讨了倍性嵌合体的分离方法、同源多倍化效应及其分子机理研究，旨在为从事植物多倍体研究的育种工作者提供参考。
1 秋水仙素离体诱导多倍体技术方法
1. 1 外植体类型的选择
秋水仙素只能作用于正在进行有丝分裂的细胞，所以，在利用秋水仙素诱导多倍体时，应选择分裂旺盛的组织作为诱变材料，如茎尖、根尖、幼叶、顶芽等。根据品种的不同选择适宜的外植体，同一品种，外植体选择的差异也能造成不同的诱导率。Huang 等[9]和李涵等[10]分别以盾叶薯蓣的愈伤组织和试管苗为材料，诱导率分别为 36. 7%和 50%.Aina 等[11]比较了落花生不同外植体多倍体诱导率的高低，结果表明种子诱导率和存活率均显着高于茎尖和愈伤组织。总之，探索适宜的外植体作为试验材料，是成功获得多倍体的有效途径。外植体的类型繁多，总结近十年部分研究结果汇总如下（ 表 1） .
1. 2 秋水仙素处理浓度、时间与方法
1. 2. 1 处理浓度 研究表明，只有在一定的处理浓度范围内，秋水仙素才能有效诱导多倍体发生； 随着浓度的升高，处理过程中外植体的死亡率也逐渐提升，或者在后期培养中，植株生长缓慢、畸形，甚至死亡[11 -60].
余道平等[49]利用秋水仙碱诱导迎阳报春的愈伤组织时发现，秋水仙素处理明显抑制愈伤组织芽的分化，并且随着秋水仙素浓度的升高、处理时间的延长，褐化死亡的愈伤组织逐渐增多。不同植物品种、外植体类型和植物生长时期对秋水仙素的敏感度不同。一般认为，诱变处理浓度为半致死率时，可获得较高的诱导率，所以诱变过程中常常使用对处理材料造成半致死效应的剂量[61].彭静等[62]探索不同浓度秋水仙素诱导贡蕉多倍体，研究发现，当秋水仙素浓度为 0. 4%,多芽体处理 48 h 时致死率为 45. 83% （ 接近半致死率） ,此时诱导率最高。若使用浓度过高，植株生长受抑制甚至死亡； 浓度过低，则不能获得纯合变异植株。
通常，秋水仙素离体诱导多倍体的处理浓度为 0. 01 ~3. 00 g·L- 1.
1. 2. 2 处理时间 施用浓度一定时，植株的死亡率随处理时间的延长而升高。处理时间过短，分生组织的有丝分裂不能同步进行，易得嵌合体； 时间过长，诱导材料受秋水仙素毒害过大。低浓度和短时间易产生嵌合体[58],这可能是由于短时间内秋水仙素无法彻底渗入外植体同步加倍所有细胞。处理浓度和处理时间是影响多倍体发生的最重要的 2 个因素，所以应设置合适的浓度梯度和时间梯度，探索最佳的组合。
1. 2. 3 处理方法 浸泡法是目前处理材料最简便、常用和有效的方法。该方法能使药液全面接触外植体，细胞分裂同步程度高，变异稳定，可以减少嵌合体的发生； 但对材料伤害较大，所以处理时间不宜过长。混培法是将外植体在含有不同浓度秋水仙素的固体培养基中诱导产生多倍体，诱导完成后转入无秋水仙素的培养基中。该方法越来越受人们的关注。Shao等[42]使用混培法和浸泡法诱导石榴多倍体，结果表明，使用混培法诱导多倍体，诱导率达 20%,使用浸泡法没有获得多倍体。混培法与浸泡法比较，其优点是：外植体不和药液直接接触，所以受伤害小； 药液消耗量小，可节约成本。由于混培法使用的浓度较小，所以处理时间延长至几天、十几天甚至几十天。王娜等[35]
用混培法诱导酸枣四倍体的时间为 40 d.
处理外植体还可用点滴法。如王波等[40]使用该方法诱导甜叶菊，多倍体诱导率为 42. 3%.但由于该方法获得嵌合体较多、耗药量大、操作麻烦，所以逐渐不被采用。不同外植体应采用不同处理方法，掌握适宜的施用浓度、处理时间和操作方法，是诱导多倍体的有效途径。
1. 3 影响秋水仙素离体诱导多倍体的其它因素
浸渍法结合震荡等方式处理外植体可使秋水仙素与外植体充分接触，促进诱变剂发挥效果。韩超等[45]报道了摇床、渗透剂对诱导巨尾桉多倍体的影响，结果表明，既不使用摇床，也不使用渗透剂，在秋水仙素溶液浓度为 0. 5%,处理时间为 96 h 时达最大诱导率41% ; 不使用摇床，但使用渗透剂，在秋水仙素溶液浓度为 0. 3%,处理时间为 48 h 时达最大诱导率 39%;既使用摇床，也使用渗透剂，在秋水仙素溶液浓度0. 2% ,处理时间为 24 h 时达最大诱导率 56% .
诱导中可使用 DMSO（ 即二甲基亚砜） 促进秋水仙素对细胞的渗透。DMSO 是化学渗透剂，使用量一般为 1% ~ 4%,过多则使外植体受 毒 害。Escandón等[38]使用含有 1% DMSO 的秋水仙素处理过长沙舅128 株植株，获得变异株 68 株。
有些植物的诱导率对基因型有很大的依赖性。
Gowacka 等[43]比较芒草品种 M. sinensis 的 4 个不同基因型（ 即 Ms10、Ms11、Ms16 和 Ms19） 的多倍体诱导效率，基因型为 Ms10 的诱导率最高，为 55%; Ms16 最低，为 18. 4%.同一外植体的不同生长时期，也会造成诱导率的差异。王冲等[50]研究了不同胚龄对诱导君子兰四倍体的影响，结果表明： 0. 01%秋水仙素处理 180 d 胚龄的未成熟胚 20 d 诱变效果最佳，四倍体诱变率最高，达 30. 8%; 处理 150 d 胚龄诱导率最低。
2 多倍体倍性鉴定
2. 1 形态学鉴定
多倍体呈现"巨大性": 茎干粗壮，叶片宽厚，叶形指数减小，叶色深绿，叶表粗糙，花瓣颜色深邃，花冠、果实硕大等。Muhammad 等[63]从形态学鉴定了 7 个品系的四倍体西瓜，结果表明四倍体西瓜与二倍体西瓜差异显着。四倍体西瓜有更粗的瓜藤，更大的叶面积，更厚的瓜皮。紫薇四倍体与二倍体相较，花蕾更大，花朵直径增加，花瓣更长且皱缩，有更好的观赏价值[64].
2. 2 组织水平鉴定
完整植株是由顶端分生组织发育而来，顶端分生组织由 3 个细胞原层组成。最外层为 LI,中间层为 LⅡ，最内层为 LⅢ[65].LⅠ发育成表皮，LⅡ层发育成花粉，叶片最中心的部位则由 LⅢ衍生的细胞组成[66].所以，检测植株的表皮、花粉、叶绿体，可以有效确定该植株是否为纯合多倍体。多倍体表皮的气孔的保卫细胞显着增大，密度减小，保卫细胞中的叶绿体颜色深，数量多； 多倍体花粉粒体积增大，有的呈畸形并伴随育性降低。Tang 等[48]通过观察二倍体泡桐和四倍体泡桐的叶表皮，得出结果： 四倍体泡桐气孔密度比二倍体显着减小，气孔增大，气孔内的叶绿体显着增多。此外，多倍体有更发达的输导组织。Graciano-Ribeiro 等[67]通过观察大量四倍体木薯的横截面，发现四倍体的髓区较大，有比二倍体更成熟的次生维管组织。
2. 3 染色体计数鉴定染色体计数是分析倍性最直接的方法[48].然而，逐株进行染色体鉴定费时费力[68].一般以根尖、茎尖和幼叶作为鉴定对象。该鉴定方法的缺点是步骤繁琐，需每株进行解离、染色、制片，并用显微镜观察数出染色体数。这种鉴定方法对试验条件和操作水准要求较高。
2. 4 流式细胞仪鉴定
流式细胞仪在植物倍性鉴定应用越来越普遍。流式细胞仪能够快速一次性检测大量样品及分析植株中不同组织的倍性[69],而且该方法对鉴定材料要求不高，在植物生长发育的早期即可进行鉴定。其鉴定原理是 DNA 相对含量与倍性水平相关[5],通过测量细胞内 DNA 含量鉴定植株倍性。
3 研究展望
3. 1 秋水仙素替代剂的应用
氟乐灵（ trifluralin） 、氨磺灵（ oryzalin） 和甲基胺草磷（ amiprophosmethyl） 等是除草剂，亦可成为有丝分裂抑制剂。与秋水仙素相比，它们对微管蛋白二聚体的亲和性更高，诱变效率更高，且无毒，使用浓度低，可减少经济成本。Dhooghe 等[70]比较了氟乐灵、秋水仙素和氨磺乐灵对毛茛的诱变效果，诱导率最高的为氟乐灵，27. 5%,其次是秋水仙素处理，23. 3%,最次为氨磺灵。Kermani 等[71]用氨磺灵诱导玫瑰，四倍体变异率最高为 66%.除了施用一种抗裂剂外，还可以采用混合抗裂剂诱导多倍体。李秀兰等[72]使用低浓度的混合抗裂剂（ 0. 01%秋水仙素 + 5 mg·L- 1氨磺灵） 处理秋石斛原球茎 8 ~10d,四倍体诱变率达 90% 以上，没有发现嵌合体。因此，上述几种除草剂在多倍体诱导上具有广阔的应用前景。
3. 2 倍性嵌合体的分离策略
秋水仙素离体诱导多倍体需要建立一套高效的技术方法。诱变材料一般为多细胞组织，如种子、离体胚、组培苗叶片、愈伤组织、丛生芽、单芽茎段等，获得的突变体多呈倍性嵌合体，一般需要采用较长时间对嵌合体进行分离。植物嵌合体是指在一株植株中，存在 2 种或 2 种以上的倍性水平。嵌合体植株不能稳定遗传，因此需要对倍性嵌合体进行分离。绝大多数研究报道中只提及嵌合体分离问题，但是未采用有效方法深入系统研究倍性嵌合体分离策略。在离体条件下，嵌合体的分离可及时进行[35].
就无性繁殖作物而言，嵌合体分离通常采用 2 种方式： 组织连续切割分离法和叶片不定芽再生技术[73].李林光等[50]利用叶片离体再生技术，从获得的苹果组培苗嵌合体中分离出同质多倍体。王娜等[35]利用组织连续切割分离法对冬枣和酸枣嵌合体进行 3 ~4 次的继代分离，获得了同质多倍体，有效防止了回复突变。秋水仙素离体诱导积雪草组培苗获得的倍性嵌合体经过不同代数培养逐渐分离出来[25].
Roux 等[74]采用不同继代方式对香蕉组培苗倍性嵌合体进行分离，结合流式细胞仪对不同代数组培苗倍性分离情况进行监测，研究结果表明香蕉组培苗倍性嵌合体采用一定继代方式可进行有效分离。Cieslak等[75]研究表明，香蕉嵌合突变体经过 6 代连续切割继代培养可获得突变纯系。组织切割连续培养法是目前有效分离嵌合体的方法，但还需寻找分离嵌合体更有效的方法，探索原倍性细胞与多倍性细胞的竞争机制以及嵌合体回复突变规律，为能及时纯化植株倍性提供坚实的理论依据。
嵌合体的发生是多倍体育种工作中的一个难题，从单细胞水平诱导纯合多倍体可有效减少嵌合体产生。此时使用的外植体为细胞悬浮液、由单细胞起源的胚状体或愈伤组织。Dutt 等[55]通过秋水仙素诱导桠柑原生质体，结合原生质体培养技术获得了柑橘的同质多倍体，没有嵌合体产生。Zeng 等[54]通过诱导柑橘愈伤组织获得了四倍体植株。Yang 等[52]处理葡萄体细胞胚获得了纯合四倍体，无嵌合体。嵌合体纯化费时费力，大大减慢了多倍体育种速度[76],所以采用分裂旺盛的愈伤组织或悬浮培养的单细胞为诱变材料，能大大提高多倍体纯合体的比率[77].
3. 3 同源多倍化效应及其在植物育种上的应用
大量研究结果表明，秋水仙素诱导产生的同源多倍体常伴随植物形态、解剖、生理、栽培特性等方面改变，如叶片变厚变大、叶色加深、叶绿素含量增加、花器官，果实变大、维管束变大、抗逆性增强[5],同时由于基因剂量的增加，某些营养成分或次生代谢产物含量也明显增多[78],因此该特点也被广泛应用于培育植物新品种。黄金艳等[79]对二倍体甜瓜及其诱导出的同源四倍体甜瓜进行维生素 C 含量的比较，发现四倍体比二倍体高 31. 58%.十六倍体的半夏类原球茎的生物碱含量是八倍体的 1. 8 倍[26].Thong-on 等[80]的研究表明四倍体积雪草不仅相较二倍体有更高的生物产量、干物质含量，且富含极具价值的三萜类化合物。多倍体菜用枸杞品种天精 3 号染色体倍性优势强大，不仅超高产，而且药用品质、营养品质优良，兼具优良的抗病性[81].
大多数果树多倍体表现强于其亲本的性状，如植株强壮、生长旺盛、花大果大、抗逆性强等特性[76]; 多倍体新桑品种不但桑叶产量和质量高，且产果量高，光合性能增强[82]; 紫锥菊四倍体与对照二倍体相比，气孔、花粉、花和种子更大，菊苣酸、绿原酸含量明显增加[83]; 小天蓝绣球（ Phlox drummondii Hook） 四倍体叶片更大更厚、光合速率明显增加[84]; Sree Harsha 三倍体木薯株系在株型、块根产量、淀粉含量、适应性上表现出突出优势，于1996 年在印度作为品种审定[85]; 木薯四倍体新品种具有抗叶斑病、长势旺、杆粗、结薯集中、早熟等特点，比对照品种6068 增产30% ~60%[86].
3. 4 同源多倍化效应分子机理研究多倍体基因表达研究相当活跃并取得了巨大成就[1].异源多倍体中的研究表明，多倍体不仅导致植物基因组大小以及结构发生改变，还影响了基因的表达模式，如 DNA 甲基化模式的改变也出现在多倍化的过程中。与异源多倍体相比，同源多倍体中基因组及基因表达的研究相对滞后[8].
同源加倍后可能引起基因组大小及结构发生改变，沙田柚同源四倍体发生了较多的基因组 DNA 位点变异，柑橘同源四倍体相对于二倍体亲本也出现了较大的位点增加或缺少[87].加倍后导致多倍体中基因表达上调或下降的现象比较普遍[8,88 -89],加倍后在不改变基因序列的情况下常会发生 DNA 甲基化等表观遗传改变[90 -91],同源多倍体与亲本在蛋白质表达上也可能存在差异[92 -93].同源加倍对基因组及基因表达变化有多大程度的影响，同源加倍引起的表型变化与基因表达相关性有多大，这些表达基因如何影响表型变化，同源加倍引起表型怎样变化等的机理研究还有很多空白，有待进一步的研究。