浅部真菌病病人的致病菌种探究

　　摘    要：　目的 了解皮肤科就诊病人浅部真菌病病种及其致病菌种的构成与分布情况。方法 2018年5月—2019年5月，我院皮肤科门诊就诊、具有典型浅部真菌病临床特征、真菌镜检及培养均为阳性病人528例，取病人皮损标本进行分离培养，通过形态观察、质谱检测系统进行菌株鉴定，对少见及疑难菌株行核糖体DNA(rDNA)ITS区序列测定。结果 528例皮肤浅部真菌病病种前3位依次是甲真菌病132例（25.00%）、足癣115例（21.78%）、股癣83例（15.72%）。分离出的致病真菌中红色毛癣菌居首位（250株，47.35%），其次为须癣毛癣菌92株（17.42%）。不同性别、年龄段浅部真菌病病种的构成和分布存在一定差异，其中股癣及体癣男性构成比明显高于女性（χ2=33.905、8.705,P<0.05），甲真菌病及足癣女性构成比高于男性（χ2=22.381、9.488,P<0.05）；股癣、马拉色菌毛囊炎病人主要集中在21～30岁年龄段，甲真菌病、花斑糠疹以31～40岁病人为主，而头癣的发病年龄高峰为≤10岁，差异均有统计学意义（χ2=6.245～15.709,P<0.05）。结论 本院皮肤科浅部真菌病病人中甲真菌病为最常见病种，浅部致病真菌以皮肤癣菌为主，红色毛癣菌为优势致病菌。

　　关键词：　真菌病; 真菌; 癣; 真菌学分型技术;

　　Abstract：　Objective To investigate the composition and distribution of superficial mycosis diseases and their pathogenic fungi in patients in Department of Dermatology． Methods A total of 528 patients with typical clinical features of superficial mycosis and positive results of microscopic fungal examination and culture who attended the outpatient service of Department of Dermatology in our hospital from May 2018 to May 2019 were enrolled.Skin lesion specimens were collected for isolation and culture,and morphological observation and mass spectrometry were used for strain identification.The sequence of ribosomal DNA(rDNA)ITS was determined for rare and difficult strains． Results Among the 528 patients with superficial mycosis,132(25.00%)had onychomycosis,115(21.78%)had tinea pedis,and 83(15.72%)had tinea cruris.Among the pathogenic fungi isolated,Trichophyton rubrumranked first(250 strains,47.35%),followed by Trichophyton mentagrophyte(92 strains,17.42%).There were some differences in the composition and distribution of superficial mycosis diseases between the patients with different sexes and ages;the male composition ratios of tinea cruris and tinea corporis were significantly higher than their female composition ratios(χ2=33.905,8.705;P<0.05),and the female composition ratios of onychomycosis and tinea pedis were significantly higher than their male composition ratios(χ2=22.381,9.488;P<0.05);most of the patients with tinea cruris and Malassezia folliculitis were mainly observed in the age group of 21-30 years,and onychomycosis and pityriasis versicolor were mainly observed in the patients aged 31-40 years,while most of the patients with tinea capitis were observed in the age group of≤10 years(χ2=6.245-15.709,P<0.05)． Conclusion Onychomycosis is the most common type of superficial mycosis diseases in our hospital.Dermatophytes are the main pathogenic fungi for superficial mycosis,with Trichophyton rubrum as the dominant pathogenic fungus.

　　Keyword：　mycoses; fungi; tinea; mycological typing techniques;
 

　　皮肤浅部真菌病为皮肤科常见疾病，其致病菌的分布特点因地域环境、社会经济条件及生活习性等不同而有所差异。为了解我院皮肤科门诊病人浅部真菌病及其病原真菌构成与分布特点，本文对就诊于我院皮肤科门诊的528例浅部真菌病病人进行病种及致病菌种分析。

　　1 、资料与方法

　　1.1、 一般资料

　　2018年5月—2019年5月，在我院皮肤科门诊就诊、具有典型浅部真菌病临床症状并且真菌镜检及培养均为阳性病人528例，其中男305例，女223例；年龄1～81岁，平均（37.30±6.29）岁。

　　1.2、 真菌镜检及培养

　　取病人病变部位的皮屑、甲屑、毛发或分泌物等。真菌镜检：将标本置于载玻片上，加1滴100g/L氢氧化钾，覆盖盖玻片，光学显微镜下观察，找到菌丝或孢子为镜检阳性。真菌培养：将真菌镜检阳性的标本接种于含0.05g/L氯霉素的沙氏培养基中，置于28℃恒温培养箱内双管培养，期间每周观察3次菌落生长情况，第4周未见真菌生长者为阴性。念珠菌转种科玛嘉念珠菌显色培养基，疑似花斑糠疹或马拉色菌毛囊炎病人标本接种于含橄榄油培养基中，37℃培养3～5d。

　　1.3、 菌株鉴定

　　1.3.1、 形态学鉴定

　　根据菌落的形态特征及其颜色、生长速度、分生孢子的形态及菌丝特征等进行初步鉴定。

　　1.3.2、 质谱检测系统鉴定

　　对纯培养菌落应用全自动快速微生物质谱检测系统进行鉴定，根据Biotyper软件得分标准进行结果判读：属的鉴定阈值下限为1.7，种的鉴定阈值下限为2.0。记录得分≥2.0的菌株，得分<1.7的菌株进行重复分析，最终仍未得到确切结果的菌株进行分子生物学鉴定。

　　1.3.3、 分子生物学鉴定

　　对少见及疑难菌株行核糖体DNA(rDNA)ITS序列测定，具体步骤如下。(1)增菌培养及模板DNA提取：使用沙氏液体培养基对待检菌株进行震荡培养（28℃，48～72h），收获菌丝体以备菌丝提取；使用氯化苄（benzyl chloride）法提取DNA基因组，具体操作方法见参考文献[1,2]。(2)rDNA-RTS扩增：用真菌通用扩增引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）、ITS2(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′），PCR扩增反应体系体积共25μL，其中包括模板DNA 2μL(20mg/L),PCR TaqMix 12.5μL，上下游引物各0.5μL，余体积用灭菌ddH2O补足。PCR反应条件：94℃预变性2min后，94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸60s，共35个循环；继而72℃保持7min延伸。PCR的扩增产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳检测[3]。(3)序列测定与分析：将扩增出的PCR产物送上海吉美生物医药科技有限公司纯化后进行双向基因测序，测序结果在GenBank(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）基因核酸数据库中进行比对鉴定菌种。

　　1.4、 统计学方法

　　应用SPSS 23.0软件进行统计处理，计数资料比较采用卡方检验。以P<0.05为差异有显着性。

　　2、 结果

　　2.1、 皮肤浅部真菌病病种及病原菌分布

　　本文528例病人中前3位浅部真菌病为甲真菌病、足癣、股癣。在分离鉴定的528株菌株中，红色毛癣菌居于首位，其次为须癣毛癣菌、马拉色菌。各菌株分布见表1。

　　2.2、 皮肤癣菌病中主要病原真菌构成情况

　　甲真菌病主要分离出红色毛癣菌（59.09%）、酵母菌（18.94%）；手足癣主要分离出红色毛癣菌（58.50%）、须癣毛癣菌（28.57%）；体股癣主要分离出红色毛癣菌（60.71%）、须癣毛癣菌（20.00%）；头癣的主要病原真菌为犬小孢子菌（83.33%）、红色毛癣菌（16.67%）。见表1。

　　2.3、 病人性别、年龄与浅部真菌病病种的关系

　　在528例病人中，男性305例，女性223例，股癣及体癣男性构成比明显高于女性，差异有显着性（χ2=33.905、8.705,P<0.05）；甲真菌病及足癣女性构成比高于男性（χ2=22.381、9.488,P<0.05）；头癣、手癣、花斑糠疹、马拉色菌毛囊炎、皮肤黏膜念珠菌病男女性别分布差异无显着性（P>0.05）。股癣、马拉色菌毛囊炎病人主要集中在21～30岁年龄段，甲真菌病、花斑糠疹以31～40岁病人为主，而头癣的发病高峰为≤10岁（χ2=6.245～15.709,P<0.05），其余4种疾病年龄分布差异无显着性（P>0.05）。见表2。

　　3、 讨论

　　浅部真菌病是一类常见的真菌感染性疾病，世界范围内人群患病率为20%～25%[4]。随着广谱抗生素、糖皮质激素的广泛应用及人员流动、环境变化，浅部真菌病患（发）病率呈上升态势[5]，且浅部真菌病致病菌种的构成与分布常表现出地区差异[6]，也在较长的时间维度下表现出变化[7,8]。了解本院浅部真菌病病种构成及病原真菌的分布特点，有助于临床工作中对浅部真菌病进行准确诊断和防治。

　　本次研究鉴定的致病真菌以皮肤癣菌为主，其中红色毛癣菌所占比例最大，须癣毛癣菌次之，这与国内部分北方地区报道结果相一致[9,10]，而上海及杭州等南方地区浅部真菌病的致病真菌以红色毛癣菌和念珠菌为主[11]，由此可见浅部真菌病病原真菌的分布具有地区差异性。本研究鉴定出的条件致病菌包括汉逊德巴利酵母菌、日本丝酵母菌、暗色真菌及尖端赛多孢子菌等，这些浅部真菌致病菌种文献中较少提及，其在人类皮肤破损或者免疫功能低下时可导致人体皮肤组织和内脏器官的真菌感染。提示临床皮肤浅部真菌病的致病菌种构成与分布可能在不断发生变化，可扩大样本量进一步统计分析。

　　表1 皮肤浅部真菌病病种及病原菌分布情况（例）

　　表2 浅部真菌病病人的性别、年龄分布（例）

　　注：*括号内数据为百分数。

　　本文的研究结果显示，在528例浅部真菌病中，甲真菌病占比最高，这与国内部分地区的研究结果相一致[10,11,12]。甲真菌病中女性构成比高于男性，其原因可能为：女性经常美甲、穿高跟鞋，易造成指（趾）甲损伤，并且女性对自身形象较男性更加关注，故女性病人就诊率高[13]。甲真菌病的致病真菌以红色毛癣菌占首位，其次为念珠菌，这与一些北方地区研究结果类似[9,14]，但海南省、南宁市等南方地区甲真菌病首位致病菌均为酵母菌[15]。表明我国北方地区甲真菌病的致病菌多以皮肤癣菌为主，其中以红色毛癣菌最为常见，随着地理位置的南移皮肤癣菌所占比例下降，而酵母菌所占比例上升，考虑其原因可能与南方地区温暖潮湿的气候有关。王莹莹等[16]对青岛地区甲真菌病的研究结果显示，甲真菌病的致病菌中红色毛癣菌占比为76.1%，念珠菌占比为10.5%；而本研究结果显示，甲真菌病中红色毛癣菌占比59.09%，念珠菌占比18.94%，与国内多个地区报道的红色毛癣菌的感染率有下降趋势而念珠菌株感染率有上升趋势的特点相符合[15,17]。分析其原因可能与气候温度及人们生活习惯改变以及近年来抗生素滥用、糖皮质激素及免疫抑制剂广泛使用有关。因此，在临床上应重视念珠菌在甲真菌病中的致病性，选择广谱抗真菌药物治疗甲真菌病。

　　本研究中足癣病人人数仅次于甲真菌病，其中女性病人的构成比明显高于男性，与相关研究结果相同[15]。足癣的致病菌种前3位依次为红色毛癣菌、须癣毛癣菌及白色念珠菌。而重庆地区调查显示，足癣的主要致病菌除了红色毛癣菌、石膏样小孢子菌及白色念珠菌等浅部真菌菌种以外，还发现了金黄色葡萄球菌及凝固酶阴性葡萄球菌等细菌病原菌定植[18]，提示临床上病情较重及易反复的足癣病人可能同时感染高耐药的细菌，对该类病人治疗时可加用抗细菌药物。

　　股癣为本院第3位常见浅部真菌病，股癣男性构成比明显高于女性，考虑与男性特殊生理结构易造成局部潮湿、不透气且活动力度强、汗腺及皮脂腺分泌旺盛，从而更有利于皮肤癣菌生长有关。本研究中股癣致病真菌包括红色毛癣菌、须癣毛癣菌、念珠菌、紫色毛癣菌及絮状表皮癣菌等，与本地区2011年股癣致病菌分布特点相比较，股癣的主要致病真菌虽未发生明显改变，但皮肤癣菌培养发现之前未鉴定出的紫色毛癣菌及絮状表皮癣菌[19]。其他一些地区研究结果亦显示，紫色毛癣菌及絮状表皮癣菌可能为股癣的致病菌[15]。表明本地区股癣的致病菌种分布可能处于动态变化中。

　　本次研究浅部真菌病病人主要集中于21～40岁年龄组。考虑其原因可能为：(1)中青年活动力度强、社会活动频繁、汗腺及皮脂腺分泌旺盛，更易感染浅部真菌；(2)中青年就医意识较强。而头癣病人主要为10岁以下儿童，这与儿童毛发结构的特殊性有关，如毛小皮的层数、厚薄、排列紧密程度与成人不同，头部皮脂腺不发达，局部皮肤缺乏游离脂肪酸；同时也与该年龄段儿童户外活动较多，喜爱与猫、犬、兔等接触有关[15]。

　　综上所述，本院皮肤科收治浅部真菌病病种及病原菌的分布大致符合国内流行趋势，但同时也具备自身特点。

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