生物钟基因、免疫系统及骨骼系统的关系研究综述

　　摘    要：　昼夜节律是生命体为适应自然环境而产生的一种生物特性, 生物钟基因调节着生命体的节律, Bmal1、Clock、PERs、CRYs、Rev-erbα等生物钟基因及下游的钟控基因发挥了重要作用。免疫细胞与骨细胞之间通过共同的细胞因子和信号通路相互作用, 调节骨代谢平衡, 免疫紊乱会导致骨代谢异常。骨免疫学的诞生有利于深入研究骨骼系统与免疫系统的相互作用, 骨免疫参与了许多骨科疾病和免疫性疾病的发生和进展。生理状态下, 生物钟基因通过调控骨骼系统与免疫系统的生物节律, 在维持骨免疫的平衡状态中发挥着重要作用。病理状态下, 生物钟基因功能异常不但导致骨骼系统和免疫系统的节律紊乱, 进一步导致骨量丢失和免疫炎症反应, 而且通过IL-1、IL-6、TNF-α、RANKL等骨免疫因子对骨代谢产生作用。反过来, 免疫炎症反应也会对生物钟基因正常功能产生影响, 进而影响骨代谢。根据生物钟基因和骨代谢自身的特点, 认识生理病理状态下生物钟基因与骨免疫的相互作用, 对骨骼系统疾病和免疫系统疾病的防治有一定的指导意义。

　　关键词：　生物钟基因; 骨免疫; 骨代谢; 免疫细胞因子;
 

　　Abstract：　The circadian rhythm is a biological characteristic of living organisms in order to adapt to the natural environment. The clock genes such as Bmal1, Clock, PERs, CRYs, Rev-erbα and clock control genes exert vital function. The interaction between immune cells and bone cells regulates the balance of bone metabolism through the interaction of common cytokines and signaling pathways, and immune disorders could cause abnormal bone metabolism. The birth of osteoimmunology is beneficial to the further study of the interaction between skeletal system and immune system, and osteoimmunology is involved in the occurrence and progression of many orthopedic diseases and immune diseases. In the physiological state, clock genes play an important role in maintaining the balance of osteoimmunology by regulating the circadian rhythm of skeletal system and immune system. However, in the pathological state, clock genes malfunction not only causes the disorders of circadian rhythm of the skeletal system and the immune system, it further leads to loss of bone mass and immuno-inflammatory reactions. It also exerts effects on bone metabolism through osteoimmunology related factors such as IL-1, IL-6, TNF-α and RANKL. The immuno-inflammatory reactions also affect the normal function of clock genes, which in turn affects bone metabolism. According to the characteristics of clock genes and bone metabolism, understanding the interaction between clock genes and osteoimmunology under physiological and pathological conditions will have certain guiding significance for the prevention and treatment of skeletal system diseases and immune system diseases.

　　Keyword：　clock genes; osteoimmunology; bone metabolism; immunological cytokines;

　　生物体的生命活动受到生物钟的调控, 包括睡眠-觉醒周期、体温、心率、血压、激素水平和认知的变化等。哺乳动物生物钟的中枢起搏器位于下丘脑视交叉上核, 外周的器官、组织、细胞的生物钟同步于中枢生物钟节律。生物钟的形成需要钟基因的参与。首先, Bmal1 (brain and muscle ARNT-like-1, Bmal1) 基因与Clock基因形成异二聚体, 与周期基因 (Period, per1-3) 和隐花色素基因 (Cryptochrome, cry1-2) 启动子的E-box结合, 驱动PERs和CRYs基因的表达, 同时形成PER/CRY蛋白复合物。PER/CRY蛋白复合物先聚集在细胞质中, 随后磷酸化迁移到细胞核中, 抑制Clock-Bmal1的活性, 关闭PER/CRY转录。这个反馈环路由核受体Rev-Erbα通过抑制Bmal1的转录调节实现[1]。当细胞核中的PER/CRY复合物降解后, PER/CRY蛋白复合物对Clock-Bmal1的抑制消除, 开始新的昼夜循环。

　　迄今人们已经发现10多种核心生物钟基因, 主要包括Bmal1、Clock、PERs、CRYs、Csnk1、Rev-erbα、RORγt等以及转录翻译后的产物。外界光、摄食等信号输入中枢节律起搏器后, 通过生物钟基因转录、翻译, 然后与输出系统构成一个完整的负反馈节律通路。Bmal1和Clock是生物钟的主要正向调控元件, Cry1、Cry2、Per1和Per2则是主要的负向调控元件。

　　生物钟基因参与了细胞生长、能量代谢、免疫调节、肿瘤形成等众多的生理过程, 生物钟基因异常会直接导致生命体昼夜节律紊乱, 还会使心血管疾病、代谢性疾病、免疫系统疾病和肿瘤等疾病的发生风险增大。

　　1、 骨代谢的自身调控特点

　　人体骨骼是一个不断更新的动态过程, 成年人每年约有10%的骨骼会发生骨重塑, 以维持骨骼的内稳态。骨吸收和骨形成的动态平衡在骨稳态中发挥着关键作用, 成骨细胞 (osteoblast, OB) 和破骨细胞 (osteoclasts, OC) 介导了这一过程。

　　OC起源于单核-巨噬细胞产生的多核巨细胞。核因子-κB受体活化因子配体 (receptor or activator of NF-κB ligand, RANKL) 是OC的分化成熟的重要因子。OB、软骨细胞、T细胞、B细胞等均表达RANKL。在肿瘤坏死因子受体相关因子-6存在时, RANKL与其受体核因子κB受体活化因子 (nuclear factor κB receptor activator, RANK) 结合并激活核转录因子-κB (nuclear factorkappa B, NF-κB) , 上调c-fos基因、活化 T 细胞核因子c (activation of T cell nuclear factor c, NFATc) 活性, 促进OC分化。RANKL活性同样受到骨保护素 (osteoporogeterin, OPG) 调控, OB和基质细胞分泌的OPG可作为诱饵受体通过结合RANKL而阻止RANKL与RANK结合, 在体外阻断OC分化成熟。所以, OPG/RANKL/RANK系统是调节骨代谢的重要反应器。

　　许多细胞因子能对OC的活性产生作用, 如白介素-1 (Interleukin 1, IL-1) 、白介素-6 (Interleukin-6, IL-6) 、白介素-17 (Interleukin-17, IL-17) 、肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α) 、1, 25二羟基维生素D3[1, 25 dihydroxyvitamin D3, 1, 25 (OH) 2D3]、RANKL等诱导OC分化;白介素-4 (Interleukin-, IL-4) 、白介素-10 (Interleukin-10, IL-10) 、干扰素-γ (Interferon-γ, IFN-γ) 、转化生长因子β (transforming growth factor-β, TGF-β) 、OPG等对OC的活性产生负向调控;IL-6和TGF-β因OC分化的阶段产生不同影响。不同的基因、生长因子、细胞因子等通过NF-κB、BMP/Smads、Wnt/β-catenin及OPG/RANKL/RANK等信号通路对骨代谢结局产生不同影响。

　　2、 免疫系统对骨代谢的调节作用

　　免疫与骨代谢关系复杂多样, 为了从细胞分子水平研究两者的相互作用和机制, 诞生了骨免疫学。骨细胞和免疫细胞均从骨髓间充质干细胞 (bone marrow stromal cells, BMSCs) 分化而来, 巨噬细胞、髓样树突细胞与OC共同来源于髓系前体细胞, OB、血液细胞和免疫细胞均来源于骨髓中的造血干细胞。

　　生理条件下, T细胞通过CD40配体与CD40结合可促进B细胞产生OPG, 骨髓中45%的OPG来源于成熟B细胞。B细胞可直接参与OC的生成, 也可通过RANKL介导OC分化[2]。B细胞敲除的小鼠出现骨质疏松症和骨髓OPG缺陷, T细胞缺陷的老鼠同样如此, 导致骨吸收增强[3]。但活化的T细胞和B细胞分泌促进OC的生成因子, 包括促进骨丢失的RANKL、IL-17 A和TNF-α等炎症因子, 骨吸收作用增强。T细胞分泌的细胞因子中, RANKL、TNF-α、IL-6等促进骨吸收, TGF-β、IL-4、IL-10和IFN-γ等阻碍骨吸收。T细胞活化后激活RANKL/RANK信号通路, 对骨吸收产生正向调控。源自CD4+T细胞中的TNF-α、RANKL可诱导OC的形成增加, TNF-α是炎症中产生OC最有效的因子之一, 在存在正常水平的RANKL的情况下, TNF-α直接刺激巨噬细胞和OC的分化[4]。

　　IL-6被认为是炎症反应中生物效应的放大因子, 是RANKL表达的受体激活剂。滑膜细胞产生的IL-6可以作为RANKL表达的受体激活剂, 激活粘附分子, 将白细胞募集到骨关节处, 破坏细胞外基质。RANKL可以使基质金属蛋白酶9、组织蛋白酶K、酒石酸盐酸性磷酸酶、碳酸酐酶II对IL-1产生反应, 共同上调NFATc1的表达, 诱导滑膜细胞增殖和OC分化[5]。研究表明[6], TNF/IL-6复合物可以通过IL-6R、NFATc1、DNAX活化蛋白12和细胞增殖途径, 诱导OC在RANK敲除小鼠的骨髓和滑膜培养物中产生。同时, IL-6、白血病抑制因子、制瘤素M在炎症性关节炎的滑膜中表达增加。说明TNF与IL-6类细胞因子可以通过非RANKL依赖性途径诱导的OC产生, 导致骨破坏。Wnt信号与成骨密切相关, IL-6与TNF-α可以一起抑制滑膜细胞和OB中Wnt信号的激活。而shRNA介导的IL-6基因敲除的小鼠可以在炎症环境中促进骨形态发生蛋白异源二聚体的表达, 诱导OB的发生[7]。用重组小鼠IL-6和IL-6R处理骨样细胞MLO-Y4并与OC前体细胞共培养, 发现IL-6和IL-6受体在骨样细胞MLO-Y4的mRNA和蛋白水平上增强了RANKL的表达和RANKL/OPG表达比。但使用JAK2抑制剂后发现OC分化能力下降。这表明IL-6也可通过激活JAK2和RANKL介导OC分化[8]。

　　对比健康人群与类风湿关节炎 (rheumatoid arthritis, RA) 患者发现[9], RA患者更容易发生骨质疏松, 这与RA患者体内的免疫细胞因子水平升高相关。同时, RA患者的I型胶原羧基端交联肽 (C-terminaltelopeptides collagen, CTX) 水平升高, Ⅰ型前胶原N端前肽 (N-terminal propeptide of type 1precollagen, P1NP) 水平降低, 这也增加了骨质疏松发生的几率。

　　3、 生物钟基因参与骨节律和骨代谢

　　3.1、 生物钟基因调节骨组织的节律

　　骨组织具有自己的生物钟, 受到Bmal1、Clock、PERs等时钟基因的调控。将离体小鼠的软骨细胞置于三维海绵上培养后, 通过分析胞浆、胞核和细胞骨架的12 000多种基因的微点阵, 均能发现节律钟基因Clock、Per1和Per2在软骨细胞上的表达, 并呈现明显的节律性[10]。在3～9周龄小鼠的股骨中发现[11], Per2基因转录的节律明显, 并且对由于外界影响导致的节律紊乱具有可逆性, 表明在骨组织具有相对稳定的生物钟。将小鼠进行光暗周期处理, 从松质骨提取mRNA并分析OC相关基因和时钟基因, OC相关基因显示出与时钟基因Per1、Per2和Bmal1同步的节律性。研究表明[12], OC上Bmal1基因和酪氨酸激酶家族相互作用进而与NFATc1启动子结合控制骨吸收。时钟基因Bmall的功能蛋白与NFATc1启动子上的E-box结合, 上调钙调神经磷酸酶的活性, 使NFATc去磷酸化, 激活CN/NFATc信号通路。

　　许多骨转换标志物在血浆或尿液中表现出昼夜变化。研究通过每间隔2 h测量10名健康男性血清中的硬骨素、CTX和P1NP, CTX存在明显的昼夜节律, 并且在5:30达到峰值[13]。研究人员通过对志愿者进行3周的睡眠限制, 对比了20～27岁的年轻人与55～65岁的老年人之间4种骨生物标志物, 包括CTX、P1NP、硬骨素和成纤维细胞生长因子23。发现年轻人P1NP的下降幅度比老年人更大, 骨形成减少但骨吸收不变, 表明昼夜节律紊乱可能在成年早期对骨代谢影响更大[14]。

　　3.2、 生物钟基因破坏对骨代谢的影响

　　时钟基因功能异常会影响骨量。研究发现Per2基因突变和Cry2基因敲除的小鼠在12周龄时骨量显着增加, 骨转换率增高。并且Cry2和Per2通过不同的途径调节骨体积, Cry2主要影响OC, 而Per2作用于OB[15]。从妊娠4.5 d的Per2转基因大鼠分离子宫内膜间质细胞, Per2-dLuc生物发光活性显着下降。用Bmal1特异性siRNA转染的子宫内膜间质细胞发现, Rev-erbα表达下调, 骨形态发生蛋白 (bone morphogenetic proteins, BMPs) 中BMP2、BMP4和BMP6上调, 其中Rev-erbα在BMPs基因转录沉默中起重要作用。表明BMPs基因通过生物钟基因的衰减而上调, 有利于向软骨组织和骨组织分化[16]。

　　研究者通过转录组测序在小鼠椎间盘中发现607个基因的表达在生理状态中具有节律性。敲除Bmal1的小鼠表现出与年龄正相关的椎间盘退变, 说明了生物钟基因的破坏可能会影响椎间盘生理病理[17]。随着机体的衰老, 老化的BMSCs会减弱向骨细胞分化增殖的能力, 导致骨骼衰老。当Rev-erbα过表达时, 会促使BMSCs提前衰老, 细胞增殖能力下降, 进而导致骨形成减少, 表明Rev-erbα与机体衰老有一定关系[18]。在Bmal1过表达的小鼠胚胎成纤维细胞中, Bmal1蛋白水平与BMSCs增殖活性之间呈正相关。这可能是由于Bmal1的过表达激活了经典Wnt途径中β-catenin因子, 使其表达增加[19]。另外, 研究者通过敲低Clock和Per2两个主要时钟基因, 观察到BMSCs分化成脂肪细胞的能力受到显着抑制, 而OB分化能力没有改变[20]。

　　1, 25 (OH) 2D3对OC和OB形成均有调节作用。在Bmal1缺陷型骨细胞中, 1, 25 (OH) 2D3可以诱导RANKL的活性增强, 导致骨破坏, 而Bmal1/Clock的过表达则可以在OB中抑制这种情况[21]。Clock基因作为重要的节律调控基因, 也可以控制1, 25 (OH) 2D3的受体——蛋白质二硫键异构酶A3的转录, 调节骨的形成。蛋白二硫键异构酶A3也被证明是一种钟控基因, 受上游节律钟基因的控制。而Clock基因突变导致小鼠细胞凋亡增加, 骨密度明显降低[22]。

　　4、 免疫与生物钟基因相互作用影响骨免疫

　　4.1、 生物钟基因调控免疫系统的节律

　　生理状态下, 免疫系统具有昼夜节律, 免疫功能一定程度上受到生物钟基因的调控。巨噬细胞、NK细胞、肥大细胞、T细胞和B细胞等细胞的昼夜节律受时钟基因的调节, 并且TNF-α、IL-6、IL-13、IFN-γ等细胞因子分泌的节律同样受到生物钟基因的调控。在健康人的CD4+T细胞中发现时钟基因E4bp4、Per2、Per3、Rev-erbα和Rorα的mRNA表达, 在时钟基因的刺激下, IL-2、IL-4和IFN-γ的表达具有稳定的节律性[23]。

　　IL-17是连接T细胞活化和OC的Th细胞亚群, 主要由辅助性T细胞17 (T help cell 17, Th17) 产生。在野生小鼠小肠固有层中发现, Th17细胞的节律受到Clock基因的调节[24]。时钟基因E4bp4参与了Th17细胞的发育。E4bp4通过与RORγt结合会抑制Th17细胞的发育, 但E4bp4可以通过Rev-erbα将Th17细胞发育与生物钟网络相连接[25,26]。

　　4.2、 抑制生物钟基因能够促进免疫炎症反应

　　Cry1过度表达则抑制昼夜节律紊乱导致的血管炎症, 这与NF-κB信号通路和cAMP/PKA途径激活有关[27]。时钟基因Cry1和Cry2的缺失会引起蛋白激酶A活化, 介导p65磷酸化, 诱导NF-κB活化和IL-6、TNF-α的表达[28]。

　　Rev-erbα是具有改变时钟功能的核激素受体之一, 主要参与脂质代谢、脂肪形成和炎症反应。Rev-erbα可在炎症状态下直接抑制Ccl2启动子中的Rev-erbα结合区域, 抑制Ccl2下游的MAPK/ERK和p38MAPK信号介导的炎症反应, 调节巨噬细胞的炎症浸润, Rev-erbα缺损的小鼠巨噬细胞中Ccl2表达增加证实了Rev-erbα的作用[29]。

　　脂多糖 (lipopolysaccharides, LPS) 能够刺激TNF-α、IL-2和IFN-γ等细胞因子的表达, 导致炎症反应。实验表明[30], Per2是NK细胞节律功能的重要调节因子。用LPS攻击Per2缺陷小鼠, 与野生型小鼠相比, Per2缺陷小鼠血清中促炎细胞因子IFN-γ和IL-1β的水平明显降低, 而TNF-α、IL-6和IL-10大致正常。肝癌骨质疏松发病率明显升高, 且发病率随肝功能损害的逐渐加重而逐渐升高。在Per2突变的肝癌小鼠模型上发现[31], 肝脏IL-6蛋白浓度的失常, 肝脏增殖基因包括c-Myc、Wee1、Ccnb1和K-ras mRNA的表达失调, 同时炎症反应增强。在RA缺氧的关节腔内, Clock可诱导血管氧化损伤、炎症反应和骨质破坏。进一步研究发现这是通过上调IL-1β、IL-6、TNF-α、细胞间粘附分子1的表达水平, 随后激活NF-κB信号, 对OC产生调控, 导致骨吸收增强[32]。

　　4.3、 免疫炎症反应使生物钟基因功能障碍进而影响骨代谢

　　免疫反应也能通过影响生物钟基因对骨代谢产生影响。成纤维样滑膜细胞 (fibroblast-like synoviocytes, FLS) 是人类和动物RA模型中的炎症介质之一。在炎症环境中FLSs被激活, 导致其表观遗传修饰, 侵袭性增强, 释放多种细胞因子和生长因子, 破坏软骨和骨[33]。在RA小鼠模型上发现[34], 黑暗条件下两个负性调控的时钟基因CRY1和CRY2抑制了FLSs介导的炎症反应。在RA和骨关节炎患者身上发现[35], 炎症刺激扰乱了FLSs的节律, 并且在生物钟重置之后IL-6和IL-1β分泌的昼夜节律破坏, 而ARNTL2和NPAS2似乎是炎症条件下受影响最大的时钟基因。其中, TNF-α能直接干扰FLSs的时钟基因表达[36]。表明炎症状态使时钟基因功能障碍, 影响正常的生物节律。在RA滑膜细胞中进一步发现, TNF-α还增强Bmal1和Cry1的mRNA表达, 但不影响Clock、Per1和Cry2的表达[37]。另外, TNF-α在滑膜成纤维细胞中以NF-κB依赖性方式在mRNA和蛋白质水平上刺激钟控基因DEC2的表达[38]。但在钙信号存在时, TNF-α与TNFR1相互作用导致Dbp表达快速下调, 时钟基因Per1、Cry1上调, 同时使分化型胚胎软骨发育基因1表达增强, 有利于向软骨细胞分化[39]。

　　研究显示, TNF和IL-1β可以抑制Per1-3、Cry1-2、PAR-bZip等多种时钟基因以及钟控基因的表达[40]。这是由于TNF导致Twist1的过表达与CLOCK竞争性结合PERs和Dbp的E-box, 导致时钟基因转录受阻[41]。在衰老小鼠OA模型中, Per2转录的昼夜节律性在软骨组织中显着降低[42]。除了年龄的影响, 还由于炎症状态下, IL-1β消除Cry1转录和Per2转录表达的昼夜节律, 而NF-κB信号通过干扰Clock/Bmal1复合物的功能参与了这一过程[43]。

　　5、 结语

　　免疫系统与骨骼系统有复杂的关系, 免疫系统对骨代谢结局有双向作用, 细胞因子的种类起着关键作用。生物钟基因既能调节免疫系统和骨骼系统的生物节律, 也可以直接对骨免疫产生影响, 还可以通过骨免疫相关的细胞因子对骨量产生不同作用。免疫反应也能抑制或增强生物钟基因的功能, 从而影响骨代谢。但由于生物钟基因众多, 目前的研究对生物钟基因的功能尚不能完全解释。同时, 骨免疫过程生理机制复杂多变, 免疫系统的细胞因子与骨细胞的关系需更多研究阐明, 生物钟基因如何影响骨免疫来调节骨细胞功能的机制需深入研究。

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