免疫学论文
关键词 : 核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白家族;炎性小体;激活机制;调控机制;
炎性小体是一种新近发现的细胞免疫信号复合体，可被多种病原体和体内免疫平衡改变产生的危险信号活化，启动一系列炎症信号级联，引发细胞焦亡和局部炎症，在抗炎和抗肿瘤过程中发挥重要作用。目前已发现的炎性小体包括核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白家族(NLRPs)、神经元焦亡抑制蛋白-NOD样受体C(NAIP-NLRC)、Pyrin和黑色素瘤2基因(AIM2)炎性小体等，其中NLRPs炎性小体是最为经典的一类。本文就NLRPs炎性小体的构成和功能、激活途径、激活调控因子及其在临床相关疾病中的意义作一综述。
1、 NLRPs炎性小体的结构和功能
炎性小体是一种存在于细胞质内的多聚复合体[1]。功能性炎性小体的激活的起点是模式识别受体(PRRs),它能感知病原体相关的分子模式(PAMPs)、危险相关分子模式(DAMPs)及引起体内平衡改变的分子进程(HAMPs)[2]。被PAMPs、DAMPs或HAMPs激活的PRRs会招募焦亡相关斑点样蛋白(ASC),该接头蛋白包括一个热蛋白域(PYD)和一个半胱天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)激活和募集域(CARD)。ASC将上游的PRRs与相对应的caspase 1结合，活化的caspase 1可水解促炎因子白细胞介素(IL)-1β和IL-18的前体，促进其成熟[3]。此外，含有CARD的PRRs, 可跳过接头蛋白ASC作用，直接与caspase 1结合形成无ASC的炎性小体复合物[4]。活化的caspase 1/4/5/11进一步水解并激活细胞焦亡关键蛋白Gasdermin D(GSDMD)所产生的GSDMD-N端，导致细胞膜孔洞形成、细胞肿胀和细胞质内容物包括大量促炎因子的释放，引起强烈的组织炎性反应[5]。
2、 NLRP1炎性小体
人类NLRP1是第一个被发现参与组装炎性小体的蛋白。不同于人类NLRP1,小鼠NLRP1具有3个亚型：NLRP1a、NLRP1b和NLRPc。除小鼠NLRP1b能被炭疽杆菌分泌的炭疽毒素特异性激活外，人类NLRP1和小鼠NLRP1b已被证实还能由刚地弓形虫、福氏志贺菌感染和毒素释放所激活[6]。
2.1、 小鼠NLRP1炎性小体
小鼠NLRP1b由感知功能结构域(FIIND)、核酸结合域(NBD)、富亮氨酸重复域(LRR)和CARD构成，其激活是通过一系列的蛋白水解过程来介导完成的。上游结构域在经过自我水解后将NLRP1b裂解为2个通过非共价键结合的片段，此时的NLRP1b尚处于自我抑制状态。炭疽毒素中的致死因子可将NLRP1b裂解为N端和C端，其N端很快被泛素化降解，释放的C端片段含有CARD,可启动炎性小体的组装[7]。有研究证实，通过人为影响NLRP1b泛素化降解的关键酶，包括E3连接酶UBR4、泛素化激活酶UBA6等的活性，抑制NLRP1b N端的降解及NLRP1b炎性小体活化[8]。N端的降解和C端的释放可能是多种诱导激活剂对NLRP1b炎性小体激活的统一机制。
2.2、 人NLRP1b炎性小体
人类NLRP1的激活较小鼠NLRP1b的激活更为复杂。有报道称，PYD内A54T、A66V和M77T等点突变，以及PYD或LRR的缺失可导致细胞IL-1β的产生增加，在NLRP1的PYD和LRR缺失的人类生殖细胞系中，发生了NLRP1的自我抑制状态被破坏和NLRP1炎性小体过度激活的情况[9]。有研究证实，上述基因突变或结构缺失导致的NLRP1炎性小体的激活与自愈性掌跖癌和角化病的个体易感性相关[10]。
3 、NLRP3炎性小体
与NLRP1炎性小体不同，NLRP3炎性小体不一定含有CARD,通常不带有CARD的NLRP3需要结合ASC完成激活。传感蛋白NLRP3能感知体内多种刺激，包括病原体、微生物毒素、核酸、三磷酸腺苷(ATP)和化学药物。NLRP3炎性小体的激活会导致质膜孔和离子流的形成、溶酶体破裂和线粒体功能障碍，从而破坏细胞结构和功能，发挥清除“危险细胞”和扩大局部炎性反应的作用[5]。
3.1 、NLRP3炎性小体激活
NLRP3的激活通常分为经典激活途径和非经典激活途径。在NLRP3炎性小体的经典激活途径中，细胞外的危险分子通过一系列受体信号转换成为细胞内信号，通过PRRs识别PAMPs或DAMPs, 启动NLRP3炎性小体的组装[11]。其中Toll样受体(TLRs)、NOD样受体(NLRs)和细胞因子受体[如白细胞介素1受体(IL-1R)和肿瘤坏死因子受体(TNFRs)]等信号感知受体及下游基因表达蛋白[如髓样分化蛋白(MyD88)、核因子-κB(NF-κB)、焦亡信号调控激酶(ASK)、脂肪酶合成酶相关蛋白(FADD)、肿瘤坏死因子受体相关因子互作蛋白(TIFA)]等参与了PAMPs和DAMPs的信号传递过程[12]。
NLRP3在结合PAMPs或DAMPs后，激活组装形成NLRP3-ASC-caspase 1复合体，成为NLRP3炎性小体。活化的caspase 1(cleaved-caspase 1)能促进IL-1前体的成熟并裂解GSDMD,GSDMD的N端插入细胞质膜形成质膜孔，使细胞发生焦亡，并释放出大量成熟的促炎因子，产生强烈的炎性反应[5]。
NLRP3的非经典激活途径由进入细胞内的细菌脂多糖(LPS)启动。革兰阴性菌分泌的含LPS的外膜囊泡能通过网格蛋白介导的内吞作用进入细胞内。鸟苷酸结合蛋白(GBP)和免疫相关鸟苷三磷酸酶(IRG)可破坏含有病原体的液泡，释放LPS[13]。
LPS成分脂质A与小鼠caspase 11或人类caspase 4/5结合，裂解GSDMD,产生质膜孔和钾离子流，触发NLPR3炎性小体的激活。有研究报道显示，进入细胞质的LPS能促使caspase 11裂解膜通道蛋白泛连接蛋白1(Panx1),引发ATP释放和细胞焦亡[14]。然而，Panx1缺陷小鼠虽然缺少caspase 11-Panx1轴，但在LPS的刺激下仍能产生不依赖嘌呤能离子通道型受体7(P2X7R)的钾离子外流和NLRP3的激活。这提示存在一种不依赖P2X7R的钾通道来调节NLRP3的非经典激活[15]。
肠道沙门菌、变形杆菌通过内质网应激可导致细胞线粒体功能障碍，释放活性氧(ROS)和线粒体DNA(mtDNA),诱导NLRP3炎性小体的活化[16]。由钙离子通道激活导致的细胞外钙离子内流，以及以内质网为主的细胞器释放入细胞质的钙离子，也能促进NLRP3与ASC的连接活化[17]。
3.2 、NLRP3炎性小体激活的调控机制
激酶NIMA相关蛋白激酶7(MEK7)是NLPR3炎性小体激活过程中的重要蛋白酶。NEK7能直接与NLRP3的NBD和LRR结合，促进NLRP3蛋白的低聚化。仅NEK7和NLRP3的结合不足以直接启动NLRP3炎性小体的激活，但是能为NLRP3炎性小体的激活提供有利条件[18]。NLRP3的激活受到多种蛋白质翻译后修饰的调控。例如，小鼠E3连接酶TRIM可通过泛素化对NLRP3产生负调控作用，而E3连接酶Pellino2可促进人和小鼠巨噬细胞中NLRP3的激活[19]。除了泛素化降解对于NLRP3激活的调控，蛋白激酶A能通过对NBD的磷酸化修饰抑制NLRP3的激活，而蛋白激酶D对NBD的磷酸化作用却能促进NLRP3的激活[20]。
4、 NLRP6炎性小体
NLRP6传感蛋白结构与NLRP3类似，由LRR、NBD和PYD构成，但NLRP6主要在肠组织细胞中高表达，发挥其免疫调节作用。组织正常代谢产物和微生物代谢产物均可调节小鼠肠组织内的NLRP6活性。胆汁酸衍生物牛磺酸是NLRP6的天然激动剂，而体内组胺和多胺精胺是小鼠NLRP6的抑制剂，共同参与维持小鼠肠道NLRP3炎性小体活化水平的稳定[21]。目前，这些能够调节NLRP6活性的代谢产物的产生机制，以及是否与肠道菌群种类相关尚不清楚。
革兰阳性菌的磷壁酸(LTA)可同时招募caspase 1和caspase 11到炎性复合体中，激活NLRP6,促进IL-18的产生。有研究提出，LTA是小鼠巨噬细胞中NLRP6的同源配体，以革兰阳性菌的LTA刺激小鼠细胞或直接以革兰阳性菌感染巨噬细胞，均能诱导NLRP6的激活和IL-18的产生[22]。对人源NLRP6的PYD结构分析进一步证实，其能自行组装形成大型丝状复合物，通过PYD-PYD作用吸引ASC,并募集caspase 1和caspase 11[23]。
有研究在敲除小鼠NLRP6基因后，观察到基因敲除后的小鼠在应对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和鼠伤寒杆菌的感染时，其存活率较对照组明显提高[24]。也有研究指出，NLRP6可能是NF-κB和MAPK信号通路的负性调控因子。这些发现提示NLRP6在体内不仅为炎性小体的传感蛋白，也可能在病原体宿主防御中发挥重要作用[25]。
5、 NLRP9b炎性小体
NLRP9b主要在小鼠小肠和大肠上皮细胞中表达，参与肠道屏障功能的维持和肠道免疫调节。小鼠NLRP9b能特异性识别轮状病毒双链RNA和DEAH-box解旋酶9(DHX9)形成的复合物并与之结合形成功能性炎性小体。与NLRP6类似，NLRP9b不能直接识别dsRNA,必须通过RNA解旋酶的作用[26],可以推测 NLRP9b和NLRP6在识别RNA的过程中可能需要其他传感器的配合，启动一系列信号级联反应。
与野生型小鼠相比，肠上皮细胞中NLRP9b或其他NLRP9b炎性小体成分缺失的小鼠对轮状病毒的易感性增强，且人为敲除NLRP9b会导致小鼠在感染轮转病毒后IL-18分泌受限，揭示小鼠NLRP9b的细胞特异性对抗轮状病毒感染中的重要性[27]。目前研究仅发现轮状病毒是NLRP9b炎性小体的激活物，对于NLRP9b炎性小体的其他激活产物，以及是否依赖DHX9或其他的呈递环节仍在进一步探寻中。
6、 NLRPs与相关疾病
NLRPs炎性小体参与多数疾病的发生和发展，并有望成为重要的药物研发靶点。近期1项研究表明，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者肝脏中NLRP3和GSDMD水平明显升高，而通过高脂诱导NLRP3-/-和GSDMD-/-小鼠，可明显改善NASH小鼠模型的炎症状态[28]。也有研究利用NLRP3敲除小鼠证明，可通过抑制由LPS激活TLRs并活化NLRP3这一信号通路所介导的肝脏炎症水平，同时改善了纤维化程度[29]。也有研究表明，P2X7受体和NLRP3这一信号通路在NASH的发生、发展中起重要作用，为未来针对P2X7受体/NLRP3的基因治疗提供了理论依据[30]。NLRPs的活化与酒精性肝炎(ALD)的发生、发展密切相关。在ALD小鼠模型中，NLRP3水平明显增加，通过腺病毒直线切割NLRP3-/-小鼠的GSDMD,会导致ALD小鼠模型的炎症水平增强[31]。
此外，肝脏切除术后NLRP3的活化会导致IL-33释放，诱导肝窦内中性粒细胞聚集，从而引起肝脏缺血再灌注损伤[32]。有研究证实，NLRP3参与了中枢神经系统[33]和心血管系统[34,35]疾病的发生和发展，对其深入的研究可为临床相关疾病的靶向治疗提供新的途径。
7、 结 语
近年来，人们发现了大量炎性小体的激活因子和调节因子，通过人为调控NLRPs等信号转导蛋白的表达，以及翻译后的蛋白质修饰来控制炎性小体的激活水平。然而，许多关于炎性小体的重要问题仍没有答案，特别是焦亡相关分子caspase 8对GSDMD的切割作用引发的炎性小体激活后细胞焦亡发生机制，以及caspase对细胞焦亡的平衡作用[36]。总之，充分认识NLRPs炎性小体调控炎性反应和细胞焦亡的途径，以及进一步研究NLRPs炎性小体调控和激活机制对炎性相关疾病靶向药物的开发至关重要。
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