Exosomes的产生、形态学特征、生物学功能

　　胞外囊泡最早是在网织红细胞成熟过程中，作为去除转铁蛋白的机制而被发现的。在随后的几十年中，不同细胞分泌的各类囊泡相继被发现，如Ectosome、Microvesicles、Exosomes、Microparticles、ApoptoticBodies，以及其他一些细胞在不同生理环境和不同刺激下分泌的囊泡。由于许多文献中容易将不同的细胞外囊泡混淆，现将其进行简单的区分：Microvesicles（100～1000nm）比Exosomes大，通过细胞膜向外萌出将其释放到细胞外；Exosomes（30～100nm），其产生是更为复杂的核内体向内萌出；而凋亡小体（＞1μm）的直径远远比前两者要大得多。Microvesicles和Exosomes的生物起源、转运、所含物质以及他们的生物学作用取决于细胞类型和刺激形式。Exosomes包含有特殊蛋白质、脂质和核酸物质，这些特殊的物质也决定了其特殊的生物学功能。最近Exosomes在病原体感染领域受到了广泛关注，研究表明其具有抗原递呈、细胞间通讯、免疫调节、临床治疗等作用。本文主要对病原体感染中，Exosomes的产生、形态学特征、生物学功能以及潜在的临床应用进行阐述。

　　1、Exosomes的产生及其形态学特征

　　Exosomes直径为30～100nm，是细胞在没有凋亡和坏死的情况下，通过核内体向内萌出，形成多泡体（multivesicularbody，MVB），并以胞吐形式释放到细胞外的膜性囊泡。Exosomes可以由多种细胞产生，目前已从一些生理性体液以及细胞或病原体的培养液中获得，例如，尿液、血浆、疟原虫感染红细胞的培养液。通过1．13～1．19g／ml的蔗糖浓缩和100000g以上的离心可以将其沉淀出来。

　　不同来源的Exosomes有其共有的蛋白质，如微管蛋白、肌动蛋白、肌动蛋白结合蛋白（actin－bindingprotein，ABP）、热休克蛋白hsc70、膜蛋白、MHCⅠ和Ⅱ类分子等。除此之外，因其细胞来源及刺激方式的不同而具有不同蛋白质，这些蛋白质与Exosomes的转运，信号传递，调节作用有关。研究表明，在各种病原体感染中，Exosomes包含有病原体的排泄、分泌蛋白。例如在疟原虫感染中，Exosomes可携带疟原虫抗原，诱导宿主产生抗体，调节免疫反应；在利什曼虫感染中，Exosomes含有糖酵解酶，有助于寄生虫在宿主内的存活及播散。Exosomes除含有病原体分泌、外排的蛋白外，也因宿主的不同而包含有特殊的宿主的蛋白。例如，隐孢子虫感染中产生的Exosomes，含有来源于宿主细胞抗菌肽；肝片吸虫感染产生的Exosomes，含有CD19和IgA的重链恒定区。

　　与蛋白质类似，Exosomes因病原体和宿主的不同而具有不同的核酸物质，如编码或非编码RNA，染色体和质粒DNA，转座子RNA等。自从发现Exosomes中含有miRNA后，Exosomes被认为是“miRNA运输载体”。Exosomes的mRNA和miRNA被释放到体液中后，可以稳定的存在并免遭RNA水解酶的消化，这取决于脂质膜的保护作用。

　　研究证明miRNA参与基因组转录后水平的调节，在细胞增殖、分化、成熟、免疫稳态的维持等方面有重要调控作用，因此我们设想Exosomes所携带的miRNA被靶细胞或病原体摄取之后可能起着一定的调控作用；Exosomes也可携带质粒DNA，把疟原虫抗药株的抗药性转移到非抗药株胞内，使非抗药株也具备相同的抗药性，用GFP质粒进行试验也得到了同样的结果。总之，Exosomes携带的miRNA以及其他调节性核酸物质（如调节性mRNA，质粒DNA等）可能在宿主和病原体之间的信号交流中起到重要的调节作用。

　　Exosomes的脂质成分基本包括：磷脂酰胆碱（PC）、胆固醇（Chol）、神经鞘磷脂（SM）、神经节苷脂（GM3）、磷脂酰乙醇胺（PE）等。但Exosomes的脂质种类及含量比例因细胞种类和病原体种类的不同而不同。由于脂质成分的存在，Exosomes可以免遭外界环境的干扰，对Exosomes内容物的保存及稳定性起到重要的作用。其保护机制有待进一步探究。

　　2、Exosomes的生物学功能

　　2．1Exosomes在病原体感染中的毒力因子运输

　　在病原体感染过程中，比起毒力因子的简单播散，Exosomes把毒力因子包裹在其中可以更好的作用于宿主细胞。

　　到目前为止，已经在真核细胞病原体分泌的囊泡中发现了300种以上蛋白质。对这些蛋白质进行蛋白质组学分析，发现其主要是热休克蛋白（70、90、60和100）以及与毒力相关的超氧化物歧化酶等。在新型隐球菌分泌的Exosomes中含有具有毒力因子的特殊化合物，包括漆酶、脲酶、葡萄糖神经酰胺、荚膜酸性多糖；在利什曼虫分泌的Exosomes中发现了毒力因子EF－1a和二磷酸果糖酶。

　　另外，新型隐球菌分泌的Exosomes包含有Hmp1，Hmp1是一种可以粘附靶细胞的跨膜蛋白，利什曼虫分泌的Exosomes也被证明含有膜毒力因子，例如膜结合性酸性磷酸酶（SAcP），以及金属蛋白酶GP63。GP63具有许多免疫调节特性，包括激活宿主的负性调节通路，直接调节宿主信号，抑制补体等。利什曼虫分泌的Exosomes也包含基体膜蛋白11，是T细胞抗原，被证明其具有免疫抑制特性。克氏锥虫分泌的Exosomes，其蛋白质与利什曼虫的类似。已证实锥虫分泌的Exosomes表面含有a－半乳糖复合物和糖蛋白gp85／TS。这些组成与病原体粘附宿主细胞有关，在囊泡定位时起到了相应的作用。

　　从一些列的研究中可以清楚的看出，真核病原体分泌的Exosomes，其表面和内部都具有免疫调节物质。但是这些物质的具体调控功能还有待进一步的研究。

　　2．2Exosomes运输感染性病原体Exosomes的生物起源和释放

　　随着病原体的进化而改变，这为病原体逃离宿主的免疫应答提供了逃逸机制。逆转录病毒和Exosomes的生物起源之间的进化关系已经被证实。对逆转录病毒的研究揭示了其借助Exosomes结合到细胞表面的机制。囊泡是HIV在人巨噬细胞内累积的主要形式，并且病毒的释放标志在Exosomes中很常见。然而尽管HIV粒子和Exosomes有相似的组成，但其起源可能不同。朊病毒可以引起人和动物的神经退行性疾病，新的研究发现Exosomes可以传播朊病毒的独特作用，并且朊病毒蛋白和其PrPc以及PRPsc可以被运送到MVBs并由Exosomes释放。

　　2．3Exosomes的免疫调控作用

　　最近的研究着眼于在感染过程中，对免疫反应控制的实质性了解，以及病原体是怎样逃逸免疫应答的。现已经清楚，这些固有的效应机制起源于特定的微生物检测模式，这种模式有助于免疫应答。这些微生物特征被命名为病原相关分子模式（PAMPs），并能够被宿主的模式识别受体识别。因此，由病原体释放并表达于其表面的PAMPs起到刺激免疫的重要作用。就性质而言细胞内的病原体其暴露在免疫系统中的情况远比细胞间的病原体要低，其中一方面的原因就是PAMPs暴露情况的局限性。我们猜测在感染过程中有病原体释放的Exosomes可以将更多的PAMPs暴露在免疫系统中，从而有效的刺激免疫反应，例如Beatty等证明了分枝杆菌细胞壁成分通过Exosomes从被感染的细胞内转运出来。通过密度梯度电泳分析，受感染的细胞通过晚期内体、溶酶体、MVBs释放分枝杆菌脂质。对鸟结核分枝杆菌的研究也发现了巨噬细胞类似的释放GPL。再者，这些研究表明分枝杆菌的PAMPs不仅仅是局限于感染细胞内，也可以被运输到临近的细胞。这些结果提出了一个关于分支杆菌成分分泌机制的重要问题。

　　Beatty等首先证实了包含有分枝杆菌成分的Exosomes的大小。另外，有实验证明分枝杆菌的成分包括GPL、LAM、PIM、海藻糖二霉菌酸酯和酚糖脂，这些物质都可以通过受感染的巨噬细胞以Exosomes释放，并且这些Exosomes可以被周围未感染的细胞捕获。有趣的是，这些脂质被未感染的巨噬细胞捕获之后可以引发促炎反应，例如PIM2可以引发TNF-α、吞噬体1、IFN-γ等的产生。最近的研究发现分支杆菌感染的细胞产生的Exosomes可诱发促炎反应，其效果同TNF-α、RANTES、一氧化氮合成酶（iNOS）所诱发的一样（图1）。这些应答的产生取决于Toll样受体的衔接分子MyD88。已有研究发现结核分支杆菌感染时巨噬细胞产生的Exosomes包含有19×103Mr的脂质的蛋白，可以结合TLR2受体，诱导IL-12p40的产生。再者，隐孢子虫感染的胆管和肠上皮细胞分泌的Exosomes可以激活TLR4／IKK2受体，Exosomes包含有上皮细胞起源的抗菌片段抗菌肽37和防御素2，Exosomes释放后其可以直接结合到隐孢子虫的表面，在体外和体内抑制隐孢子虫的活性。研究表明，受鼠疟原虫的红细胞分泌的Exosomes携带疟原虫抗原，如CPGODN1826等，可以诱导体内IgG2a和IgG2b的产生，进而增强机体抵抗力。

　　在病原体感染中，宿主一方面通过激发各种各样的途径来抑制病原体的存活及增强自身的抗感染能力，如前所述通过Exosomes的激发促炎反应以及产生抗体杀灭病原体。另一方面病原体也进化出许多条途径来支持自身的播散、生存和扩增，例如建立新的细胞通路以利于入侵不同的宿主，建立不同的免疫逃逸策略，包括：改变宿主的抗原，建立自身耐受性，功能性免疫失活，免疫抑制，寄生虫多肽和宿主抗原之间的分子模拟，从宿主细胞获得唾液酸结构域，以及病原体甲基转移酶调控抗原变化等。Exosomes的产生涉及以上许多过程。胞内病原体和寄生虫引起的感染往往是慢性的，并能引起病原体对宿主免疫反应的重大调节，病原体感染过程中产生的Exosomes参与了免疫调节过程。最近的研究发现3D7和CS2恶性疟原虫株系感染红细胞后产生Exosomes可以携带30多种疟原虫蛋白，其中分子模拟宿主蛋白可能是疟原虫在感染过程中进行免疫调控的途径之一，已被证实的蛋白包括红细胞结合蛋白1、红细胞结合蛋白2、红细胞结合蛋白3和阶段性肝抗原等。从宿主获得核酸序列和蛋白质结构域序列可以发生于病原体—宿主共存的不同时期，Exosomes可能在分子交换中起到了重要的作用。因此对病原体来源的Exosomes相关蛋白进行分析将有助于了解其在感染性疾病中的免疫功能。

　　2．4Exosomes介导病原体—宿主之间的相互作用

　　最近不断有文献证明病原体通过释放Exosomes来和宿主细胞之间进行通讯。例如利什曼虫通过结合CR3和甘露糖受体激活吞噬作用，类似的也可以通过受体———配体的相互作用介导Exosomes的吞噬。

　　在恶性疟原虫感染的红细胞中，疟原虫可以通过Exosomes进行基因的传递，从而使疟原虫从耐药株获得耐药性；另一方面Exosomes可以促进疟原虫向有性形式分化。因此认为Exosomes可以介导细胞间交流和促进疟原虫的在宿主中的扩增和传播。除此之外，发现还有许多病原体分泌Exosomes可以介导病原体———宿主之间的相互作用，如表1所示。

　　Exosomes不仅可以转运蛋白质和脂质，也可以转运核酸物质，因此我们假设其可作为病原体———宿主之间传递基因信息的重要机制。研究卵巢滤泡发现卵泡液和颗粒细胞之间的Exosomes介导细胞间的交流涉及到miRNA；再者，Ronquist等发现起源于前列腺的Exosomes可以携带染色体DNA片段运送到精子。因此基于以下几点，我们认为Exosomes介导的病原体———宿主之间的相互作用涉及到水平基因转移：Exosomes具有转移DNA在内的核酸物质的能力；Exosomes保护和传送遗传物质到不同的器官；Exosomes传送其内容物到不同组织和器官。

　　2．5Exosomes的临床运用及疫苗制备

　　Viaud证实了树突状细胞来源的Exosomes可诱导免疫反应的产生，例如黑色素瘤和非小细胞肺癌患者。配上一定的免疫佐剂和丝裂原，Exosomes可以作为新的免疫治疗途径。类似的，在病原体感染中Exosomes也可以作为免疫治疗的新途径。如，在弓形虫感染的树突状细胞分泌的Exosomes运送到脾脏后，激活Th1调节的弓形虫特异性免疫反应，从而提高抗感染能力。因此可以有望通过体外注射Exosomes来抵抗弓形虫感染。又如，用疟原虫感染产生的Exosomes免疫小鼠可以诱导小鼠IgG的产生，该IgG可以特异性识别疟原虫，用致死量的鼠疟原虫感染被Exosomes免疫过的小鼠，发现存活率明显高于对照组，并且促进了网织红细胞的增多。布氏锥虫分泌MVs抑制宿主树突状细胞的成熟淋巴细胞同种异体反应，从而导致了锥虫耐受性的产生。Exosomes也被用来做链球菌感染的评估，肺炎链球菌疫苗的免疫特性主要取决于肺炎链球菌荚膜多糖，荚膜多糖诱导骨髓来源的DC细胞产生的Exosomes免疫后可以产生IgG3。

　　综上所述，病原体或宿主细胞释放的Exosomes，一方面在感染性疾病的诊断和预后中具有重要的作用；另一方面，因其在免疫调节方面的特殊生物学功能，为将来抗感染免疫中疫苗的开发提供新的思路。

　　3、结语

　　Exosomes自发现以来，已证实许多细胞可以分泌，如网织红细胞、肿瘤细胞、神经元细胞、小胶质细胞等。Exosomes是由蛋白质，核酸物质，脂质组成，不同的组成成分决定了Exosomes的特殊生物学功能。在病原体感染过程中，许多病原体及宿主细胞均可分泌Exosomes，其具有毒力因子的运输、传播感染性病原体、免疫调节、介导病原体———宿主之间的相互作用等重要的生物学功能。因此，对病原体感染过程中Exosomes的组成、结构及其生物学功能进行研究，可以进一步了解感染过程中病原体与宿主之间的相互作用机制、促炎及抗炎机制、免疫的正性调控和负性调控机制等。

　　目前，临床治疗病原体的感染主要集中于抗生素的应用，长期使用抗生素使得大量耐药株的出现，导致病原体感染的治疗日益困难。因此，Exosomes这种易于操作、调控、具有抗原呈递功能及免疫调节功能的亚细胞成分，一方面，为病原体感染中的临床诊断和疫苗的开发提供了新的思路；另一方面，可以考虑将Exosomes做为药物载体和生物标记用于临床治疗和生物研究。虽然近年来Exosomes的研究受到了广泛关注，但主要集中在网织红细胞、肿瘤细胞、吞噬细胞等方面。在病原体感染方面的研究相对较少，领域相对较窄，只是集中于疟原虫、HIV、隐孢子虫等常见病原体的研究。而许多病原体在这方面还存在空白，有待于进一步的探索。