中性粒细胞在结核病免疫领域中的相关研究综述

　　结核病是由结核分枝杆菌( Mycobacterium tuberculosis,Mtb) 感染引起的以呼吸系统感染为主的慢性感染性疾病。由于结核病导致的组织损伤主要由机体的免疫系统介导,而且在结核病患者体内往往存在 Th1 型免疫应答受抑,Th2 型免疫应答水平异常升高的现象,结核病也被认为是一种免疫紊乱性疾病,机体免疫应答的方向和水平在很大程度上决定着结核病的发展与转归。长期以来,人们围绕结核病免疫相关的 T 淋巴细胞( 尤其是 CD4+的 Th1 细胞) 、巨噬细胞和树突状细胞( dendritic cells,DC) 进行了大量研究,并取得了一些可喜的进展。目前,为多数研究者肯定的观点认为,Th1 型免疫应答在结核病的适应性免疫应答中起关键作用,是介导结核病保护性免疫的主要群体; 巨噬细胞作为机体抗 Mtb 感染的主要免疫效应细胞,在结核病的保护性免疫应答中也发挥有重要的作用。但是,对于参与结核病免疫的另一个重要的细胞群体,也是 Mtb 感染后最先由外周血迁移至感染病灶的细胞中性粒细胞即多形核中性粒细胞( polymorphnuclearneutrophils,PMN) 的研究却明显滞后。庆幸的是,近年来PMN 在结核病免疫中的作用受到越来越多的关注,相关的研究也取得了较大进展。现就近年来 PMN 在结核病免疫领域中的相关研究进展进行综述。

　　1、 Mtb 感染过程中 PMN 的变化及功能

　　很早就有研究发现,Mtb 感染后 PMN 会迅速从外周血迁移至 Mtb 感染的局部。研究显示,无论 Mtb 是经血液还是呼吸道途径感染人体,PMN 均会很快趋化至感染部位( 一般在感染后的 1 ~3 h 内到达感染部位,并在 12 ~ 24 h 时达到峰值) 。PMN 到达感染部位后会很快活化并吞噬 Mtb。由于PMN 本身是机体主要的免疫效应细胞之一,研究者推测 PMN可能对于 Mtb 感染的早期控制有重要作用。Yang 等的研究也证实 PMN 能在 Mtb 感染早期迅速吞噬并杀死 Mtb,从而促进 Mtb 的清除。但同时也陆续有研究提示,PMN 可能参与了结核病导致的组织免疫损伤和 Mtb 慢性感染的活化过程。Eum 等在活动性肺结核患者的痰标本、支气管肺泡灌洗液和肺组织坏死空洞的周围均检测到大量的 PMN,而且,Eum 等的研究发现被 PMN 吞噬入的 Mtb 的复制速度较细胞外的 Mtb 还快。在其他疾病模型中的研究也提示,PMN活化后释放的一些活性酶类会对正常组织造成损伤。

　　关于 PMN 在 Mtb 感染过程中扮演的具体角色,动物实验研究同样充满争议。同样是利用 PMN 的特异性单克隆抗体去除 Mtb 感染动物体内的 PMN,有些研究者发现实验动物的疾病进展更快、组织病理损伤更为严重,提示 PMN 有助于机体控制 Mtb 的感染; 但有的课题组则发现去除 PMN 后实验动物的组织荷菌量较对照组显著减少,组织损伤程度明显下降,动物的存活期显著延长; 还有的报道认为 PMN 的去除与否对结核病的严重程度无明显影响。

　　由此可见,PMN 在结核病的发生发展过程中扮演的角色如同一把双刃剑,它可以通过吞噬和杀伤效应发挥抗 Mtb 感染的功效,但同时,活化后的 PMN 会通过产生的活性产物造成组织器官的直接损伤,促进结核病的进展,也可能通过诱导过度的炎症性反应导致病理性免疫应答,从而对组织器官造成间接损伤。对于患者最终的临床表现以及上述研究结果出现的争议,目前推测可能与 PMN 浸润的数量、感染机体整体的免疫学状态、以及感染宿主的遗传背景有关。总之,目前对 PMN 在结核病免疫中发挥的功能的认识还很不全面,对其进行系统、动态的研究势在必行。

　　2、 PMN 对 Mtb 的吞噬及杀伤作用

　　目前的研究发现 PMN 主要通过两种机制介导对 Mtb 的吞噬: 直接识别和调理作用。直接识别机制主要通过模式识别受体介导。其中,Toll 样受体2( Toll-like receptor 2,TLR2)和 TLR4 的作用非常关键。此外,补体受体 3、补体受体 4 以及甘露糖结合凝集素等也在 PMN 识别 Mtb 的过程中发挥重要作用。除了直接识别,PMN 还能通过调理作用识别和吞噬 Mtb,研究提示这种作用与抗分枝杆菌抗体相关,如 de Valliere 等的研究发现,注射 BCG 疫苗的志愿者体内的 PMN 吞噬 BCG 的能力明显增强。但目前,对参与 Mtb 调理作用的具体抗体并不是很清楚。

　　研究发现,PMN 吞噬 Mtb 后会迅速活化,产生大量活性氧( reactive oxygen species,ROS) 和抗菌肽等杀菌物质,并通过脱颗粒作用释放大量颗粒酶,但对于 PMN 对 Mtb 的杀菌能力目前仍存大很大争议。如 Yang 等的研究提示 PMN 能通过 NADPH 氧化酶介导产生大量 ROS,对被吞噬的 Mtb 进行有效地杀伤,姜丽娜等研究发现 IL-12 能增强 PMN 吞噬和杀伤 Mtb 的活性,但 Corleis 等的研究则发现活化 PMN 产生的 ROS 不仅不能杀伤 Mtb,还会导致 PMN 的坏死,从而促进 Mtb 的免疫逃逸。Corleis 等的研究同时发现,这种逃逸机制与 Mtb 携带的差异区 1( region of difference 1,RD1) 基因产物相关,若敲除 RD1 基因,Mtb 则不能诱导 PMN 坏死且能被 PMN 杀伤。此外,还有的研究提示 PMN 可能被 Mtb“胁迫”,成为 Mtb 向远处组织播散的“特洛伊木马”。

　　通过对上述研究进行分析可以发现,造成这些矛盾结果的原因可能与 PMN 免疫效应作用的多样性、感染宿主及 Mtb菌株的遗传背景等有关。如 Yang 等的研究主要从 PMN 与巨噬细胞的相互作用方面,探讨 PMN 在斑马鱼结核性肉芽肿形成早期的免疫保护作用。而 Corleis 等的研究则以纯化的人外周血 PMN 为研究对象,探讨离体的人源性 PMN 对不同毒力 Mtb 的杀伤作用。因此这些研究虽然都以 PMN 为研究主体,但研究所采用的 PMN 的来源、遗传背景、所处环境等均有差异,效应检测时间及采用的感染菌株也不相同。对PMN 在结核病发生、发展过程中的作用进行系统和动态的研究将有助于客观、全面地了解 PMN 在结核病免疫中的功能。

　　3、 Mtb 感染过程中 PMN 的免疫调节作用

　　长期以来,人们认为 PMN 仅仅作为一种吞噬细胞,在Mtb 感染的早期参与抗结核病的固有免疫应答,因此较早期的研究大都局限在 PMN 对 Mtb 的吞噬和杀伤能力的探讨方面,在很大程度上限制了人们对 PMN 在抗结核病免疫中的认识。然而目前越来越多的证据显示,PMN 在抗结核病免疫中的作用远非先前认为的那样简单,其不仅参与了 Mtb 感染早期的固有免疫应答,也参与了结核病适应性免疫的诱导和调节,对结核病免疫的发展有重要影响。已有的研究显示,PMN 在 Mtb 感染过程中发挥免疫调节的途径和机制至少包括以下几个方面。

　　3. 1 分泌细胞因子 研究发现,感染 Mtb 后 PMN 可分泌一系列细胞因子,如 IL-8、IL-10、IL-12、肿瘤坏死因子-α( tumornecrosis factor,TNF-α) 、巨噬细胞炎性蛋白 1、单核细胞趋化蛋白 1 等。通过这些细胞因子,PMN 至少可通过以下 2 种机制参与结核病免疫的调节: 诱导或趋化更多的其他免疫细胞至感染部位。如 PMN 产生的 IL-8、巨噬细胞炎性蛋白 1 和单核细胞趋化蛋白 1 等是多种炎性细胞的趋化因子,可吸引更多炎性细胞到感染灶部位。调节其他免疫细胞的分化方向和活化水平。如 IL-12 是经典的 Th1 型细胞因子,可诱导初始T 淋巴细胞向 Th1 方向分化; TNF-α 是介导结核病保护性免疫的关键细胞因子之一,可促进巨噬细胞和 T 细胞等的活化,在机体清除和控制 Mtb 感染的应答过程有重要的调节作用。

　　Swant 等通过建立 PMN 和巨噬细胞的共培养体系发现,感染了 Mtb 的 PMN 可分泌大量 TNF-α,当采用特异性单克隆抗体中和 PMN 分泌的 TNF-α 后,巨噬细胞的活化水平明显下降,直接证实了 PMN 产生的 TNF-α 可促进巨噬细胞的活化。此外,有研究证实,Mtb 感染后病灶局部微环境中的 IL-10 主要来源于 PMN。一方面,这些 IL-10 可能在限制机体的免疫病理反应方面发挥作用,但另一方面又可能抑制巨噬细胞对 Mtb 的反应性,并限制机体的获得性免疫应答。

　　3. 2 通过释放细胞内容物参与对其他免疫细胞的调控PMN 发生活化后可通过脱颗粒作用释放大量的细胞内容物,如弹性蛋白酶、乳铁蛋白、碱性磷酸酶、抗菌肽、人中性粒细胞多肽( human neutrophil peptides,HNP) 等。近年的研究发现,这些释放至胞外的生物活性物质除直接参与杀菌作用外,还可能作用于周围的免疫细胞,参与抗结核病免疫的调节。

　　如 Tan 等的研究发现,发生凋亡的 PMN 可被邻近的巨噬细胞吞噬,并将其携带的 HNP 等杀菌物质释放至巨噬细胞中,显著增强巨噬细胞杀灭 Mtb 的能力。其后,利用 PMN 释放的亚组分进行的研究进一步肯定了这种作用。如体外研究证实,PMN 释放的游离 HNP 可被巨噬细胞和 DC 吞噬,而吞噬 HNP 后,巨噬细胞对 Mtb 的杀菌能力明显增强,DC 提呈Mtb 抗原、激活抗原特异性 T 细胞的功能也获得很大提高。

　　随后,研究证实 PMN 释放的乳铁蛋白同样能增强抗原提呈细胞对分枝杆菌抗原的提呈功能,促进特异性 T 细胞的活化和增殖。同样,PMN 释放的颗粒酶也能被巨噬细胞摄取,增强巨噬细胞杀伤和清除 Mtb 的能力。如 Jena 等研究发现,PMN 的嗜苯胺蓝颗粒被巨噬细胞吞噬后能增强巨噬细胞内Mtb 吞噬体与溶酶体的融合水平,大大增强巨噬细胞对 Mtb的杀伤能力。因此,通过释放的颗粒酶和 HNP 等生物活性物质调节其他免疫细胞的功能也是 PMN 参与结核病免疫的重要机制之一。

　　3. 3 通过直接接触调控其他免疫细胞的功能 人体试验及动物模型中的研究均已证实,CD4+T 细胞介导的 Th1 型免疫应答在结核病的保护性免疫中起主要作用,是机体清除或控制 Mtb 的主要获得性免疫机制。但对活动性结核病患者的研究同时发现,T 细胞免疫应答可能也参与了结核病的组织免疫损伤。因此,适度的 T 细胞免疫应答对控制 Mtb 的感染至关重要,但对于如何维持这种精确的免疫平衡目前我们仍然不是很清楚。

　　根据目前公认的免疫双信号学说,T 细胞的活化需要2 个信号系统共同参与。第一信号由抗原提呈细胞 ( antigenpresenting cell,APC) 表面的 MHC / Ag 复合物与 T 细胞抗原识别受体( T cell receptor,TCR) /CD3 结合后提供,第二信号则由 APC 上的共刺激分子与 T 细胞上相应的受体结合后介导。研究证明,T 细胞接触 MHC/Ag 复合物后可能产生 2 种截然不同的后果: 增殖、分化为不同的效应细胞; 无反应性或凋亡。这 2 种结果的出现以及 T 细胞分化的方向主要决定于APC 所传递的共刺激信号。因此,APC 表面共刺激分子的类型和表达水平对 T 细胞免疫应答的性质及强度至关重要。

　　而近年的研究发现,在 PMN 中同样表达有 APC 相关的表面分子和共刺激分子。如 Abi Abdallah 等的研究发现,在体外与 T 细胞进行混合培养后,小鼠 PMN 可同时高表达MHC Ⅱ类分子和共刺激分子如 CD80 和 CD86,具备专职 APC的双信号系统表型。以 OVA 激发小鼠 PMN 后,PMN 可高效处理 OVA 抗原并通过 MCH Ⅱ类分子依赖的方式将 OVA 肽抗原提呈给 OVA 特异性的 T 细胞,启动抗原特异性 Th1 和Th17 细胞的免疫应答,证实 PMN 可发挥专职 APC 的类似功能。McNab 等发现,活动性肺结核病人的 PMN 表面程序性死亡配体 1( programmed death ligand-1,PD-L1) 表达显著升高,由于 PD-L1 与 T 细胞表面程序性死亡分子 1( programmeddeath-1,PD-1) 结合后,产生共抑制信号,抑制 T 细胞增殖分化和细胞因子的分泌。因此,推测 PD-L1 升高可能是结核病的一种致病因素。除了通过共刺激分子调控 T 细胞的分化和活性外,研究发现 PMN 还能通过其他直接接触的方式参与其他免疫细胞的功能调控。如 Hedlund 等的研究发现,与直接用 Mtb 感染 DC 相比,采用感染 Mtb 的 PMN 与 DC 混合培养能更有效地促进 DC 成熟,极大提高 DC 提呈 Mtb 抗原的能力。该研究同时发现,这种促进 DC 细胞成熟的作用依赖于感染 Mtb 的 PMN 与 DC 细胞的直接接触,其中 DC 特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素分子 ( dendritic cell-specificintercellular adhesion molecule-3-grabbing nonintergrin,DC-SIGN) 和细胞黏附分子-巨噬细胞分化抗原 ( macrophagedifferentiation antigen-1,Mac-1) 在这一过程中起着关键作用,说明 PMN 能通过凝集素-整合素途径参与对 DC 的功能调节,进而影响机体抗 Mtb 感染的获得性免疫应答。

　　4、 结语和展望

　　PMN 是人体抵抗病原微生物入侵的主要免疫效应细胞之一。Mtb 感染机体后,外周血中的 PMN 可在1 ~3 h 内迁移至Mtb 感染的局部,迅速吞噬 Mtb 并发生自身活化。目前对PMN 在 Mtb 感染过程中所发挥的作用的研究和认识仍存在很大争议,但越来越多的研究证实 PMN 在结核病免疫中扮演了重要的角色。虽然 PMN 在 Mtb 感染过程中表现出功能复杂且充满不确定性,不过已有研究提示 PMN 的功能具有很大可塑性,这为以 PMN 为靶标进行结核病的治疗、延缓或逆转结核病过程中的组织免疫损伤提供了可能。当然,目前的研究说明我们对 PMN 在结核病免疫中发挥的作用的认识还很不全面,已有的研究大多停留在对现象的观察上,对其中的分子机制还未进行深入地探讨,因此有必要对 Mtb 感染过程中PMN 的变化、功能和相关机制进行深入和系统的研究。